磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种采用纳米材料包裹内交联血红蛋白的纳米囊及其制备方法技术领域。
背景技术：
血液是人体的重要组成部分，大量失血会造成代谢严重障碍乃至危及生命，输血已经成为不可缺少的临床急救措施和医疗手段。近年来，全世界对输血需求量日益增加，但是由于人类血液血型复杂，输血反应难以克服；天然血液的保存期短，加之目前输血传播传染病威胁及献血员数量不足，安全有效的血源日益紧缺。因此，人血液代用品已成为国际关注的研究热点而被列为二十一世纪的重大研究开发领域。
血红蛋白衍生物类红细胞代用品包括化学修饰血红蛋白(Hb)，基因重组Hb和脂质体包囊Hb等几种类型，而化学修饰Hb又分成内交联Hb、多聚Hb和高分子化合物共轭Hb。
内交联Hb由于该制品容易与血管内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)结合引起血压上升，因此该类制品已停止临床应用。例如，Baxter公司的产品DCLHb(采用双阿司匹林内交联Hb)和Haemosol公司的Haemolink(采用棉籽糖内外交联Hb，内含较高浓度的分子量为64000的血红蛋白单体)。
基因重组Hb由于该制品可以解决Hb来源问题，不受输血相关传染病的影响，因此具有较好的前景。但由于目前技术水平的限制，重组Hb在细菌或真核细胞中的有效表达率较低，因此造成Hb纯化的费用过大，影响了该制品的研发。Baxter公司开发的产品Optro(rHb2.0)，通过基因突变方法改变了Hb空间结构，使重组Hb不容易与NO结合，目前该公司停止了该产品的临床应用，对此还未作任何说明。
多聚Hb在目前所有的红细胞代用品中该类制品是最有希望获得FDA批准的产品，Northfield公司产品Polyheme(多聚人Hb)已完成了III期临床，Biopure公司的产品Hemopure(多聚牛Hb)正在美国申报生物制品市场准入执照(BLA)，该制品已经获得批准用于动物治疗以及在南非获得批准用于外科手术治疗。随着对红细胞代用品研究的进一步深入，该制品也将面临一些新的挑战。
高分子化合物共轭Hb该制品与同类产品比较具有较长的血浆半衰期(48小时)，低P50值(血红蛋白氧饱和度达到50％时溶液中的氧分压值)和高粘度等特点。Apex公司产品PHP(聚氧乙烯共轭人Hb)已开展治疗败血症的III期临床。Sangart公司的产品Hemospan(MP4)，虽然还处于临床前研究，但已引起人们的广泛关注。
虽然经过不断的努力，第一代血红蛋白代用品的研发已经取得了令人瞩目的进展，但所有这些制品都未克服血红蛋白在血浆中容易发生自氧化的缺陷。因此国外已将研究重点转移到微囊包裹血红蛋白技术开发，特别是加强了对生物降解纳米材料包囊血红蛋白(人工红细胞)的研发。与传统红细胞代用品相比，生物可降解多聚物包裹的血红蛋白纳米囊具有以下特点①采用的新型纳米材料在体内可降解成水和二氧化碳，降解速率可以通过改变多聚物的种类，聚合物分子量和分子形状进行调节；②多聚物比脂质体牢固、通透性好、膜的用量少，具有透过葡萄糖和其他亲水小分子能力；③血红蛋白纳米囊的直径控制在80～150纳米，只有天然红细胞的1/60左右大小，在发生血管梗阻等循环障碍时，可以输送生命赖以生存的氧；④不容易通过血管内皮的缝隙进入组织间质，克服了无基质血红蛋白分子与NO结合造成的血管收缩，血压上升的危害；⑤可以将超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、高铁血红蛋白还原酶等影响血红蛋白携氧能力的酶包含在纳米囊中；⑥可将血红蛋白纳米囊制备成冷冻干粉，便于储存和运输。
目前已有一些文献报道了采用生物可降解材料包囊血红蛋白的方法，但这些方法由于需要特殊的设备，操作复杂，成本昂贵而无法进一步推广到工业化制备包囊血红蛋白制品。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种采用生物可降解材料壳聚糖和海藻酸钠包裹磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的纳米囊。
本发明还有一个目的就是提供一种简单、快速制备上述纳米囊的方法。
壳聚糖(chitosan)是通过甲壳素chitin脱乙酰化制备而成的天然高分子直链多糖，化学名称为(1-4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖。海藻酸钠(sodium alginate)是存在于褐藻类中的天然高分子，从其结构上看是由β-1，4结构的D型甘露糖醛酸的钠盐(M)和α-1，4结构的L型古罗糖醛酸的钠盐(G)共聚而成。不同种类的海藻酸钠所含的(M)和(G)片段比例不同，通常M/G比介于0.4～1.9。
由于壳聚糖分子链上有大量的伯氨基，在一定pH条件下有如下平衡存在
当pH＜pKa时，分子链上的主要以-NH3+形式存在，带正电荷。
当pH＞pKa时，分子链上的主要以-NH2形式存在，不带电荷。
海藻酸钠的分子链上有大量的羧基，在一定pH条件下有如下平衡存在
当pH＜pKa时，分子链上的主要以-COOH形式存在，不带电荷。
当pH＞pKa时，分子链上的主要以-COO-形式存在，带负电荷。
所以在合适的pH条件下壳聚糖和海藻酸钠可以通过正、负电荷吸引结合。由于这种静电相互作用不涉及热交联过程中的高温及化学交联过程中的共价键形成，不会影响包载物的性质，因此特别适于大分子蛋白或细胞的包载。
本发明所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的纳米囊，包括纳米壳聚糖和海藻酸钠包裹材料及磷酸吡哆醛内交联血红蛋白。
所述的用于包囊的血红蛋白经过磷酸吡哆醛修饰，具有良好的释氧能力，P50值在28～32mmHg之间。
所述的包裹有磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的纳米囊直径为60-120nm，只有天然红细胞的几十分之一左右大小，在发生血管梗阻等循环障碍时，可以输送生命赖以生存的氧。
磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊的制备方法，其步骤是将磷酸吡哆醛内交联血红蛋白加入到含氯化钙的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后再加入壳聚糖溶液，继续搅拌均匀后采用滤膜去除未形成包囊的壳聚糖、海藻酸钠和血红蛋白，并进一步浓缩、洗涤，最后获得的包囊血红蛋白溶液用除菌过滤器过滤。
所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的浓度为0.1～0.5g/L，血红蛋白浓度越高，形成的包囊粒经越大，当然血红蛋白浓度太低也会使包囊效率降低。
采取用壳聚糖滴入海藻酸钠的方式形成纳米囊，磷酸吡哆醛内交联血红蛋白与海藻酸钠的质量比为1∶(2～10)，最佳的质量比为1∶5；海藻酸钠和壳聚糖质量比为5∶1～1∶1，优选为2∶1；氯化钙在溶液中的最终浓度在0.001～0.01g/L之间。在上述配比下可形成稳定的血红蛋白纳米囊，否则会使直径增大，甚至形成凝胶。为了控制包囊血红蛋白的直径，本发明所有反应溶液pH控制在3.0～5.5之间，当pH增大时，所形成的微囊粒经也相应变大，考虑到血红蛋白在酸性环境下容易生成高铁血红蛋白，因此pH也不能过低。
本发明去除未形成包囊的壳聚糖、海藻酸钠、血红蛋白时根据最后需要的包囊粒径进行选择，最好采用膜孔径为10kD的超滤膜；洗涤液采用医用乳酸林格氏液或其它常用的洗涤液，最后获得的包囊血红蛋白溶液用0.22μm除菌过滤器过滤即可。
本发明的有益效果本发明所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊直径为60-120nm，具有良好的携氧能力和生物相容性，对各种血液成分无不良影响；制备时没有使用有机溶剂，无任何毒性，并且所用的纳米包裹材料易分解。本发明的制备方法简单、快速，可望大规模实际应用。
图1是纯化血红蛋白高效液相检测图，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是蛋白吸光度图2是磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊电镜扫描3是磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊原子力显微镜图具体实施方式
以下将通过具体实施方式
的形式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的具体实施方式
。
1.血红蛋白的纯化取库存过期全血一袋，分装在50ml塑料离心管内，3500rpm离心10min。用玻璃滴管吸去血浆部分，并且加入等体积生理盐水混匀后3500rpm离心10min，重复上述步骤3次。将上述所得洗涤红细胞按体积比1∶9加入水，混匀后置于4℃冰箱内过夜。上述溶血液以10000rpm(8600g)离心50min。取上清血红蛋白溶液，弃去沉淀物。上清溶液0.22μm除菌过滤后存于4℃冰箱。将上述所得血红蛋白溶液以体积比1∶2加入0.1M Tris-HCl(pH8.00)调整pH后上离子交换柱。并以含0.1M NaCl Tris-HCl(pH8.00)梯度洗脱。收集洗脱液，弃去前后3％体积溶液。血红蛋白收集液进行30kD膜超滤，加入0.1M Tris-HCl(pH7.40)循环收取膜上溶液，采用HiCN法测定血红蛋白浓度。
2.血红蛋白磷酸吡哆醛修饰血红蛋白摩尔比1∶4加入5’-磷酸吡哆醛(溶于0.1M Tris-HCl pH7.40)，持续通入氮气5h，摩尔比1∶4加入新鲜配置的NaBH4溶液(溶于0.001M NaOH)，继续通入氮气30min完成反应。修饰后溶液加入0.1M Tris-HCl pH7.40以低温离心30kD膜超滤3500rpm 20min，重复多次去除多余NaBH4。
3.包囊血红蛋白为了减少生物毒性，不使用有机溶剂，本发明采用水溶液直接滴加法，以恒流泵控制匀速滴加，并在磁力搅拌下进行。在4℃条件下将浓度为0.3g/L(溶于0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH3.8)的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白以1ml/min的速度滴加到等体积含0.004g/L氯化钙的海藻酸钠溶液，海藻酸钠溶液的浓度为1.5g/L(溶于0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH3.8)，搅拌均匀后再以1ml/min的速度滴加等体积浓度为0.75g/L的壳聚糖溶液(溶于0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH3.8)，为了使所形成的粒径更均一，滴加完毕后，继续搅拌30min。用膜孔径为10kD的超滤膜去除未形成包囊的壳聚糖、海藻酸钠、血红蛋白，并进一步浓缩，洗涤液采用医用乳酸林格氏液，最后获得的包囊血红蛋白溶液用0.22μm除菌过滤器过滤。
磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊原子力显微镜图(见图3)显示其直径为60.627nm。
采取用壳聚糖滴入海藻酸钠的方式形成纳米囊，氯化钙的浓度低于0.01g/L。
此方法为一种简单、快速、可大规模应用的包囊血红蛋白的新方法，包囊血红蛋白直径为60-120nm，具有良好的携氧能力和生物相容性，对各种血液成分无不良影响。
权利要求
1.一种磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊，其包括纳米壳聚糖和海藻酸钠包裹材料及磷酸吡哆醛内交联血红蛋白。
2.如权利要求1所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊，其特征在于纳米囊的直径为60-120nm。
3.如权利要求2所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊，其特征在于磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的P50值在28～32mmHg之间。
4.权利要求1～3所述的任一磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊的制备方法，其步骤是将磷酸吡哆醛内交联血红蛋白加入到含氯化钙的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后再加入壳聚糖溶液，继续搅拌均匀后采用滤膜去除未形成包囊的壳聚糖、海藻酸钠和血红蛋白，并进一步浓缩、洗涤，最后获得的包囊血红蛋白溶液用除菌过滤器过滤。
5.如权利要求4所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊的制备方法，其特征在于磷酸吡哆醛内交联血红蛋白与海藻酸钠的质量比为1∶(2～10)，海藻酸钠和壳聚糖质量比为5∶1～1∶1，氯化钙在溶液中的最终浓度在0.001～0.01g/L之间。
6.如权利要求4所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊的制备方法，其特征在于磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的浓度为0.1～0.5g/L。
7.如权利要求4所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊的制备方法，其特征在于反应溶液pH为3.0～5.5。
8.如权利要求4所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊的制备方法，其特征在于所说的滤膜是膜孔径为10kD的超滤膜。
全文摘要
本发明涉及一种采用纳米材料包裹内交联血红蛋白的纳米囊及其制备方法技术领域。本发明所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白的纳米囊，包括纳米壳聚糖和海藻酸钠包裹材料及磷酸吡哆醛内交联血红蛋白。本发明所述的磷酸吡哆醛内交联血红蛋白纳米囊直径为60－120nm，具有良好的携氧能力和生物相容性，对各种血液成分无不良影响；制备时没有使用有机溶剂，无任何毒性，并且所用的纳米包裹材料易分解。本发明的制备方法简单、快速，可望大规模实际应用。
文档编号A61K9/50GK1857721SQ20061002538
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月31日 优先权日2006年3月31日
发明者范华骅 申请人:上海市血液中心
文档序号 :
【 1113051 】
技术研发人员：范华骅
技术所有人：上海市血液中心
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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