一种叔醇水解酯酶、编码基因、载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种叔醇水解酯酶及其编码基因，以及含有该编码基因的载体和利用该载体转化获得的重组基因工程菌及其应用。
背景技术：
酯酶是一种能水解脂肪酸酯产生游离脂肪酸，将油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。酯酶作为一类重要的生物催化剂，因其具有选择性高、催化反应条件温和、无污染等特点，其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，酯酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，因此该酶的应用前景十分广阔。近年来，将生物催化剂应用于有机相中催化化学反应已经成为生物催化领域中的研究热点。因其在有机相中催化具有诸多优点如底物在有机相中溶解度高；产物易于回收；在有机相中能促进反应热力学平衡向正向移动；酶作为生物催化剂具有高度的区域选择性和立体选择性，在有机相中可一定程度上提升酶的立体选择性；生物催化酶在有机相中热稳定性增强，因而可以提高反应温度增加反应速度等等。酯酶作为一类广泛应用于医药、食品、化工等行业的重要生物催化剂，在有机相中的生物催化具有极其重要的应用，例如在有机相中低水环境下能催化合成难溶于水的医药中间体和精细化工品，能运用在一些重要药物中间体的手性拆分中等等。然而，大多数的生物催化酶在有机溶剂中酶活性会受到极大影响，使其难以实现规模化的工业生产。在有机介质中维持较高的酯酶活性及酯酶催化底物的广泛性，是当今生物催化过程中面临的难题。因此，开发高活性、有机溶剂稳定性强的酯酶具有巨大的应用潜能。叔醇底物是一类非常有价值的手性平台基化合物，可以广泛的用于药物中间体的合成，但是手性叔醇类底物具有较强的空间位阻，因此其化学合成工艺构建是十分具有挑战的，目前在大量合成高纯度的手性叔醇工艺开发上，尤其是绿色环保的工艺，仍然具有十分迫切的需要。近年来，人们发现具备GGG(A)X结构域特征的酯酶，因为在活性中心特异的苷氨酸侧链，可以提供一个较大的底物结合位点，能够高效的催化含有手性叔醇酯底物的水解，因此该类酯酶催化的手性叔醇酯底物的工艺具备广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种叔醇水解酯酶、编码基因及其应用。本发明采用的技术方案是一种叔醇水解酯酶htC23，所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列。所述保守性变异多肽，是指记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失或插入附加氨基酸序列，但不足以改变其性能，仍具有酯酶活性。优选的，所述叔醇水解酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示
MSQQQLESIIQMLKSQPIAGKPSIAETRAGFEQMAAMFPVEADVKSEPVNAGGVKSEWVTAPGADPGRA VLYLHGGGYVIGSISTHRSFAGRISRAAKARVLVIDYRLAPEHPFPAAVEDSVAAYRWMLSTGLKPSRIAVA⑶SAG GGLTVATLVAIRDAKLPVPAAGVALSPWVDMEGVGDSMKTKAAVDPMVQKDGLIEMAKAYLGGKDPRTPLAAPLYAD LAGLPPLLIQVGTAETLLDDSTRLAERARKAGVKVTLEPWENMVHVFQIFASILDEGQQAIDKIGAFIRANAE.。本发明中所述酯酶与常规酯酶相比，具备活性高、耐受有机溶剂稳定性好，并且PH 耐受范围广等特征。
本发明还涉及一种所述叔醇水解酯酶的编码基因。 优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示atgtcacaac aacagcttga atcaattatc cagatgctca agtcgcagcc tatcgcgggcaaaccctcga ttgcggagac ccgcgcggga tttgagcaga tggccgcgat gtttccggtcgaggctgacg tgaagagcga gccggtcaat gcgggcggcg tcaagtcaga atgggtgacggcgccgggcg cggacccggg ccgcgcggtg ctttacctgc acggtggcgg ctacgttatcggctcgatca gtacgcatcg ctcgttcgcg ggacgaatct cgcgcgctgc caaagcgcgagtgctggtga tcgactaccg gctcgcgcct gagcatccgt ttcccgcagc ggtcgaggattccgtcgccg catatcgctg gatgctctcg accgggttga agccctcgcg aatcgcagtcgcgggagact ccgccggtgg cggtctgacg gttgcgacgc tggtcgcgat tcgcgatgcgaagcttccag ttccggccgc gggtgtggcg ctgtcgccgt gggtcgatat ggaaggagtcggcgattcga tgaagacgaa ggcggctgtc gatccgatgg tccagaaaga cggcctgatcgagatggcaa aggcttatct cggcggcaag gatccgcgca cgccgctcgc cgcgccgctctatgccgacc tcgccggtct cccgccgctg ctgatccagg tcggcaccgc ggagactctgctcgacgact cgacgcggct agcggagcgc gcgcgcaagg cgggagtgaa ggtaacgctggaaccgtggg aaaatatggt ccacgtcttc cagatcttcg cgtcgattct cgacgaagggcagcaggcga tcgacaaaat tggagcgttc atccgcgcca acgccgagta a。编码本发明酯_htC23蛋白质的核苷酸序列可以编码包括在一个或者多个位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或者添加在内的&忧23蛋白质，且不破坏由其编码的htC23蛋白质的酯酶活性。例如通过修饰所述的核苷酸序列可以得到编码与上述 EstC23蛋白质基本相同的蛋白质的DNA，通过定向诱变、易错PCR、DNA重组、DNA杂交等技术从而使一个、多个或者部分氨基酸片段涉及到缺失、取代、插入或者添加，通过公知的突变处理可以获得如上所述进行了修饰的DNA。在适合的异源表达宿主中以多拷贝表达经历了如上所述的进行修饰获得的DNA， 可以获得编码与&忧23蛋白质基本相同的蛋白。众所周知的是蛋白质的氨基酸序列与编码它的核苷酸序列可以在菌种、菌株、突变株或者变株之间稍有不同，因此编码基本上相同蛋白质的核苷酸可以在埃希氏大肠杆菌的菌种、菌株、突变株或者变株中实现表达并获得基本上相同的蛋白。因此，与前述SEQ ID NO. 1核苷酸序列相比具有不低于70%的同源性的DNA，以及包括不低于70%的同源性DNA的特异性杂交体可编码具有酯酶活性的蛋白质的DNA，均在本发明的保护范围之内。本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的
重组基因工程菌。本发明所述编码基因可用于制备重组叔醇水解酯酶。
权利要求
1.一种叔醇水解酯酶，其特征在于所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列。
2.如权利要求1所述的叔醇水解酯酶，其特征在于叔醇水解酯酶氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—种权利要求1所述叔醇水解酯酶的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
5.含有权利要求3所述编码基因的重组载体。
6.一种利用权利要求5所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
7.权利要求3所述编码基因在制备重组叔醇水解酯酶中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为构建含有权利要求3所述编码基因的重组载体，将所述重组载体转入大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养， 培养液分离得到含有重组叔醇水解酯酶的菌体细胞，菌体细胞经细胞碎、分离纯化获得所述重组叔醇水解酯酶。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQID NO. 1所
10.权利要求1所述叔醇水解酯酶在水解结构如式(I)所示的叔醇酯中的应用；
全文摘要
本发明提供了一种叔醇水解酯酶及其编码基因，以及含有该编码基因的载体和利用该载体转化获得的重组基因工程菌及其应用。所述叔醇水解酯酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列。本发明的酯酶易于原核表达，可以采用本专利中所述的重组载体、菌株及制备方法高效生产本发明酯酶；而且，本发明酶的制备方法简便高效，易于大量表达，适于工业化生产。
文档编号C12N1/15GK102321594SQ20111024542
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者吴慧丽, 杜鹏飞, 熊小龙, 王秋岩, 金鹏 申请人:杭州师范大学
文档序号 :
【 528240 】
技术研发人员：王秋岩,金鹏,杜鹏飞,熊小龙,吴慧丽
技术所有人：杭州师范大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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