次级代谢物同属物分布调节法的制作方法

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专利名称：次级代谢物同属物分布调节法的制作方法
技术领域：
本发明提供采用重组DNA技术产生聚酮化合物(polyketide)的重组方法和材料、通过调节氧压力调节聚酮化合物同属物分布(congener distribution)的方法。本发明涉及农业、动物饲养、化学、医药化学、医学、分子生物学、药学和兽医技术领域。
背景技术：
聚酮化合物代表由2-碳单元通过一系列缩合反应和后续修饰而合成的一大类不同的化合物。聚酮化合物存在于许多类型的生物体中，包括真菌和菌丝体细菌，尤其是放线菌。存在各种聚酮化合物结构，而且聚酮化合物包括大量的具有不同活性的化合物。这些化合物的例子包括红霉素、FK-506、FK-520、巨霉素、那波霉素(narbomycin)、竹桃霉素、苦霉素(pieromycin)、雷帕霉素(rapamycin)、spinoeyn和泰乐菌素。鉴于采用传统的化学方法生产聚酮化合物有困难以及在野生型细胞中非常低的产率，人们在寻找改进的或其它生产聚酮化合物的方法上具有极大的兴趣。可参见PCT出版物WO93/13663、WO95/08548、WO96/40968、97/02358和98/27203；美国专利号4874748、5063155、5098837、5149639、5672491、5712146和5962290；以及Fu等，1994，Biochemistry，339321-9326；McDaniel等，1993，Science，2621546-1550；和Rohr，1995，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34(8)881-888。本文将上述各文献的内容纳入作为参考。
自然界中，聚酮化合物由聚酮化合物合成酶(PKS)合成。这些酶是多个大蛋白质的复合物，与脂肪酸生物合成中催化2-碳单元缩合的合成酶相类似。PKS酶由PKS基因编码，该基因通常由3个或多个开放读框(ORF)组成。已知两类主要的PKS酶，其不同之处在于它们的组成和合成模式。这两类主要的PKS酶通常被称为I型或“定型(modular)”和II型或“迭代(iterative)”PKS酶。第三类PKS酶主要在真菌细胞中发现，它具有I型和II型酶的特征，被称为“真菌”PKS酶。
定型PKS负责产生大量的12-、14-和16-元大环内酯抗生素，包括红霉素、巨霉素、酒霉素、那波霉素、竹桃霉素、苦霉素和泰乐菌素。定型PKS的各ORF可含有一个、两个或多个酮合成酶活性的“模块”，各模块由至少两种(如果是负荷模块的话)和多种、通常是三种(对于最简单的补充模块)或多种酶活性或“结构域”组成。这些大的多功能酶(＞300000kDa)通过多步骤途径催化聚酮大环内酯(macrolactone)的生物合成，涉及酰基硫酯间的脱羧缩合，接着进行多轮不同的β-碳加工活性循环〔参见O′Hagan，D.，The polyketidemetabolites；E.Horwood纽约，1991，本文将其纳入作为参考〕。
在过去5年，利用6-脱氧赤酮酸内酯B(6-dEB)合成酶(DEBS)基因开发基于质粒的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)表达系统，大大促进了定型PKS的功能和特异性研究〔可参见Kao等，1994，Science，265509-512；McDaniel等，1993，Science，2621546-1557；和美国专利5672491和5712146，本文将各文献纳入作为参考〕。此DEBS的质粒基因系统的优点是，它克服了用于操纵天然DEBS宿主生物红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的冗长而有限的技术，使得构建重组PKS更容易，并通过提供“清晰”的宿主背景而减少PKS分析的复杂性。这个系统还加速了链霉菌中的第一组合性定型聚酮化合物库的构建(参见PCT出版物WO98/49315和00/024907，本文将各文献纳入作为参考〕。
通过遗传操纵PKS而控制聚酮化合物生物合成方面的能力，如单体选择和β-碳加工的程度，已在新颖抗生素的组合工程方面激发了极大的兴趣(可参见Hutchinson，1998，Curr.Opin.Microbiol.，1319-329；Carreras和Santi，1998，Curr.Opin.Biotech.，9403-411；和美国专利号5712146和5672491，本文将各文献纳入作为参考〕。这种兴趣已引起了通过编码PKS酶的基因的重组DNA技术而进行的克隆、分析和操纵。所产生的技术使得人们可操纵已知的PKS基因簇，以由该PKS以高于自然界的水平合成产生聚酮化合物，或者在本来不产生聚酮化合物的宿主中产生聚酮化合物。该技术还使得人们可生产其结构与已知PKS基因簇产生的聚酮化合物相近但不相同的分子。
在通常不表达I型和II型PKS酶的宿主细胞中产生聚酮化合物方面仍存在大量的兴趣。例如，已报道在异源大肠杆菌、酵母和植物细胞中生产真菌聚酮化合物6-甲基水杨酸(6-MSA)。参见Kealey等，1998年1月，“不生产聚酮化合物的原核和真核宿主中产生聚酮化合物天然产物”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95505-9；美国专利号6033883和PCT出版物98/27203和99/02669，本文将这些文献纳入作为参考。异源酰基载体蛋白合成酶(ACPS)的共表达需要或大量增加6-MSA的异源生产，为此，对于大肠杆菌，培养基补充物将有助于增加6-MSA生物合成中利用的丙二酰CoA底物的水平。还可参见PCT出版物97/13845，本文将其纳入作为参考。
其它聚酮化合物的生物合成需要除了丙二酰CoA外的其它底物。这些底物包括如丙酰CoA、2-甲基丙二酰CoA、2-羟基丙二酰CoA和2-乙基丙二酰CoA。但在许多可用作生产聚酮化合物的宿主的种种宿主细胞中，许多细胞天然不生产这种底物。此外，对于起始底物和补充分子的操纵，需操纵各种宿主中的裁剪(tailoring)酶，以获得不同的聚酮化合物产物。此外，宿主在聚酮化合物同属物生产中起着重要的作用。
细菌被分类为严格需氧菌(对于其生长氧是必需的)、兼性需氧菌(氧不是必需的，但有氧会促进生长)、空气耐受厌氧菌(氧对生长没有影响)、严格厌氧菌(氧抑制生长)，或者微需氧菌(生长时需要低浓度的氧)。需氧菌的氧依赖性胞内加工由氧化酶和加氧酶介导。严格需氧菌的例子是大多数的粘细菌和放线菌。需氧菌在微氧(低氧)条件下的生长是令人感兴趣的，因为培养物的生长性能和初级代谢物和次级代谢物的产生通常与在氧过量化的条件下所观察到的情况不同(Winkelheusen等，1996；Schneider等，1999；Jensen等，2001；Liefke等，1990；Kaiser等，1994；Dick等，1994〕。下文将给出完整的作者引用的参考文献及其出版年份，本文将各文献全文纳入作为参考。
放线菌目(Actinomycetales)和粘细菌目(Myxococcales)成员产生噁许多次级代谢物具有强大和不同的生物活性。聚酮化合物是一类由称为聚酮化合物合成酶(PKS)的大的多功能酶产生的天然产物，通常随后再经酶途径修饰(Carreras等，2000)。这些裁剪途径酶的作用可包括糖基化、羟基化、甲基化、环氧化，或者对分子的核结构进行的其它各种变化。
在这些裁剪途径中产生的各种中间化合物通常具有不同于最终化合物的生物能力。这方面的例子是抗菌化合物红霉素B、C和D，这些化合物可通过一酶途径而被加工成更强的红霉素A同属物，该酶途径包括氧依赖性EryK羟化酶(参见

图1)。可将红霉素及其13-取代的类似物用作用于胃肠道促动(prokinetic)剂(称为促胃动素，motilide)的半合成产物的前体。但是，红霉素B对于EryK酶来说是非常差的底物，且它基本上是此途径的支路终端产物(Lambalot等，1995)。红霉素D分子的最终命运取决于EryG甲基化酶和氧依赖性EryK羟化酶之间的竞争性反应。先前已显示，红色糖多孢菌生物转化6-脱氧赤酮酸内酯B(6-dEB)类似物过程中，溶氧浓度在决定红霉素A或B同属物是否是这些培养的优势终端产物方面是关键的(Carreras等，1990)。
最近人们对埃博霉素(epothilone)类化合物(图2)产生了兴趣，因为这类化合物对于强抗癌化合物紫杉醇而言是潜在的化疗继任者(Bollag等，1995；Gerth等，1996)。紫杉醇(Taxol)和埃博霉素类化合物通过相同的作用机制使微管稳定，但是埃博霉素类化合物能有效抵抗紫杉醇抗性肿瘤，并且更易溶于水(Kowalski等，1997；Su等，1997)。已在能产生其野生型的微生物纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的发酵肉汤中鉴定到至少39种不同的埃博霉素变体和相关化合物(Hardt等，2001)。已报道在四种主要的埃博霉素同属物A、B、C和D中，埃博霉素D具有最高的治疗指数(Chou等，1998；Chou等2001)，但纤维堆囊菌产生的量非常低(Gerth等，2000)。埃博霉素PKS的酰基转移酶4(AT4)结构域可掺入丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA补充单元中，通过这一选择性而影响埃博霉素A和B之间或埃博霉素C和D之间的最终比例(Gerth等，2000)。埃博霉素D同属物是环氧化成埃博霉素B的直接前体(图3)，此环氧化反应由EpoK单加氧酶催化(Julien等，2000；Gerth等，2001)。
红霉素B和埃博霉素D是次级代谢物裁剪途径的中间产物的例子，此中间产物有时是所需的产物。此外，还有其它许多天然产物的例子，其中单加氧酶反应对于途径中间产物加工成最终产物是必需的。例子包括将密实菌素生物转化成能降低胆固醇的药物pravastatin〔Serizawa等，1991；Watanabe等，1995〕、植物激素赤霉素的生产(Tudzynski等，1998)、真菌的霉菌毒素柄曲霉素(sterigmatocystin)的生产(Keller等，2000)和抗癌药物阿霉素的生产(Lomovskaya等，Walczak等，1999)。
可采用遗传方法消除这些氧依赖性酶的活性，但由于各种原因，这种遗传工程方法可能证明是难以或不可能实现的。单加氧酶的直接遗传灭活需要知道其序列并获得其序列，还需要操纵宿主生物体的DNA的能力。本发明提供一种变通方法，用于生产作为主要产物的这些中间产物，而不需要对裁剪酶进行任何的遗传操纵。
鉴于这种在异源宿主细胞中大量生产有价值和有用的聚酮化合物潜力，需要能够在修饰的同属物分布中生产聚酮化合物的宿主细胞。本发明通过提供重组的宿主细胞、表达载体和在多种宿主细胞中生产聚酮化合物的方法而帮助满足所述需要。
下述文献提供了本发明的背景信息，本文将它们的全文纳入作为参考。
Winkelhausen，E.；Pittman，P.；Kuzmanova，S.；Jeffries，T.，“在氧有限的恒化器培养基中由念珠菌Candida boidinii生产木糖醇”，Biotechnol.Lett.1996，18，753-758。
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Lomovskaya，N.；Otten，S.；Doi-Katayama，Y.；Fonstein，L.；Liu，X.；Takatsu，T.；Inventi-Solari，A.；Filippini，S.；Torti，F.；Columbo，A.；Hutchinson，C.R.，“波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)中阿霉素的超表达dnrU酮还原酶和dnrV基因和doxA细胞色素P-450羟化酶基因的克隆和表征”，J.Bacteriol.1999，181，305-318。
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发明概述在一个实施例中，本发明提供一种不需要基因操纵聚酮化合物合成酶(PKS)基因或裁剪霉来调节异源宿主细胞中聚酮化合物同属物分布的方法。
在一个实施例中，本发明提供代谢功能经遗传工程改造(metabolicallyengineered)的异源宿主细胞，通过在所述宿主细胞培养过程中控制氧压力，可操纵该宿主细胞产生聚酮化合物同属物的某种分布。
在一个实施例中，本发明提供能生产聚酮化合物的重组宿主细胞，当在调节的氧压力条件下培养时，该细胞转而产生同属物。在一个实施例中，该重组宿主细胞是纤维堆囊菌宿主细胞，能生产埃博霉素A和B，且当在氧耗尽的条件下培养时转而产生埃博霉素C和D。
在一个实施例中，异源宿主细胞产生的聚酮化合物是埃博霉素，通过调节培养期间的氧压力，可调节该埃博霉素同属物分布以产生埃博霉素D。
在一个实施例中，通过调节氧压力而产生的埃博霉素同属物分布导致在氧过量压力条件下产生较高的埃博霉素D/埃博霉素C比例。在另一实施例中，埃博霉素C与埃博霉素D的比例在氧耗尽的条件下增加。在一个实施例中，由异源的粘球菌黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-32.25株生产埃博霉素同属物。在一个实施例中，在K111-32.25株中，在氧过量压力下生产埃博霉素A和B，而在氧耗尽压力的条件下生产埃博霉素C和D。
在一个实施例中，本发明提供一种不需要进行遗传操纵而通过调节埃博霉素聚酮化合物合成酶(PKS)簇的模型4的氧压力而改变埃博霉素的乙酰转移酶(AT)结构域的方法。在一个实施例中，菌株K111-32.25的AT特异性转移为甲基丙二酰CoA，结果导致向C-12位具有甲基的同属物(埃博霉素B或D)转移。
在一个实施例中，本发明提供代谢功能经遗传工程改造的具有活性EpoK单加氧酶的异源宿主细胞产生的新的聚酮化合物。
在一个实施例中，通过调节异源宿主细胞培养期间的氧压力而产生的新聚酮化合物是埃博霉素506。
附图的简要说明图1显示红霉素B、C和D，可通过包括氧依赖性EryK羟化酶的途径将其加工成更强的红霉素A同属物。
图2显示各种埃博霉素类化合物的化学结构。(a)埃博霉素A(R1＝H；R2＝S)；埃博霉素B(R1＝CH3；R2＝S)；埃博霉素G1(R1＝H；R2＝O)；埃博霉素G2(R1＝CH3；R2＝O)。(b)埃博霉素C(R1＝H；R2＝S)；埃博霉素D(R1＝CH3；R2＝S)；埃博霉素H1(R1＝H；R2＝O)；埃博霉素H2(R1＝CH3；R2＝O)；(c)10，11-二脱氢-埃博霉素A(R1＝H)；10，11-二脱氢-埃博霉素B(R1＝CH3)；(d)10，11-二脱氢-埃博霉素C(R1＝H)；10，11-二脱氢-埃博霉素D(R1＝CH3)。
图3显示埃博霉素D同属物是EpoK单加氧酶催化而环氧化形成埃博霉素B的直接前体。
图4显示在(a)氧过量的或(b)氧耗尽的条件下培养的K111-32.25(EpoK+)株，在氧耗尽的条件下产生的细胞密度比在氧过量条件下培养相同菌株时产生的细胞密度高60％。
图5显示(a)在产生最大活性的EpoK酶和埃博霉素A和B作为主要的最终产物的氧过量条件下，(b)在限制该酶的活性和埃博霉素C和D作为主要最终产物的条件下，和(c)在氧耗尽的条件下这些培养的结果与另一菌株(K111-40.1)在氧过量条件下(其中EpoK酶的活性已通过遗传工程消除)获得的结果类似的条件下，从培养的菌株K111-40.1(EpoK+)发酵液获得的树脂抽提物的HPLC色谱。
图6显示在氧过量条件下(a)10，11-二脱氢-埃博霉素B的插烯Payne重排(vinylogous Payne rearrangement)转变成(b)Epo506。
图7显示在氧耗尽和氧过量条件下K165-79.7株的培养，产生10，11-二脱氢-埃博霉素D和Epo506间同属物比例的转移。
图8显示培养纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)Soce K111-150.17期间氧压力的调节转移了埃博霉素产物分布。(a)在50％溶氧(DO)条件下的细胞生长；(b)和(c)低氧压力。
图9显示三种不同的溶氧条件下的滴度时间过程。
图10为显示在t＝112小时时50％溶氧条件下获得的epo A和epo B同属物分布的HPLC色谱图。
图11显示在112小时时0％溶氧条件下获得的埃博霉素A、B、C和D峰值的HPLC色谱图。
发明详述本发明提供一种生产作为主要产物的聚酮化合物中间产物的变通方法，该方法不需要对裁剪酶进行任何基因操纵。本发明方法利用根据布达佩斯条约在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏的宿主细胞，该宿主细胞已获得保藏号。黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-32.25株已于2000年5月1日保藏，保藏号为PTA-1700，黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-40.1株已于2001年1月18日保藏，保藏号为PTA-2712。纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)K111-150.17株已于＿＿＿＿＿＿＿保藏，保藏号为＿＿＿＿＿＿。
先前已描述了用于在异源的黄色粘球菌系统中生产埃博霉素D的进料批次培养法(fed batch cultivation process)。在该进料批次培养过程中，可调节或调整溶氧压力，由过量的约50％的溶氧饱和度调整到氧耗尽或0％溶氧(测量的)，以转移同属物的生产。在进料批次培养过程中，通过自动控制搅拌速率，将溶氧压力维持在50％的空气饱和度。当搅拌速率的上限值被限定在不足以维持该溶氧压力的值时，通过增加细胞密度而产生的连续增加培养物代谢需求，可最终耗尽培养肉汤中的氧。该培养物然后处于以下的代谢状态，在该状态中氧溶解到培养肉汤中的速率等于其被细胞消耗的速率。此代谢状态导致溶氧探针的读数为0，表明在该培养肉汤中没有检测到残余的氧活性。然后，可开发此培养状态用于将该加工途径的氧依赖性裁剪酶的活性减到最小，同时仍提供足够的氧以维持培养物的活力。
在生产埃博霉素的整个过程中，通过控制搅拌速率，将产生埃博霉素B的菌株(EpoK+)K111-32.25(ATCC保藏号PTA-1700，2000年5月1日)的培养物维持在过量的(50％的饱和度)和耗尽的(0％)溶氧压力的条件下(图4a、4b)。氧过量的条件导致EpoK酶的活性最大，并产生埃博霉素A和B作为主要的最终产物(图5a)。氧耗尽条件限制了该酶的活性，产生埃博霉素C和D作为主要的最终产物(图5b)。在氧耗尽化条件下的这些培养结果与使用另一菌株(K111-40.1，ATCC保藏号PTA-2712，2001年1月18日)在氧过量条件下(其中EpoK酶的活性已通过遗传工程消除)产生的结果类似(图5c)。
调节溶氧压力除了影响埃博霉素类化合物的最大总滴度外，还影响埃博霉素A和B(或C和D)同属物间的比例(可参见实施例2，表1)。但是，获得这些最大滴度的时间不依赖于菌株类型或生物反应器中的氧水平，因为表1中所述的所有三种培养条件都在第12天前后获得它们的最大总埃博霉素滴度。可将丙二酰CoA或甲基丙二酰CoA补充单元(extender unit)掺入埃博霉素PKS的酰基转移酶4(AT4)结构域中，这种选择性将影响这些埃博霉素同属物间的最终比例(17)。氧浓度可能或对丙二酰和甲基丙二酰-CoA的胞内汇集分布产生间接的影响。K111-40.1(EpoK+)和K111-32.25(EpoK+)在氧过量条件下的培养导致向在C-12(埃博霉素B或D)具有甲基的同属物的明显转移，表明细胞偏爱在此条件下生产和/或掺入甲基丙二酰-CoA(表1)。
EpoK+菌株在氧耗尽的条件下培养产生的细胞密度比相同菌株在氧过量下培养中获得的细胞密度高60％(图4a、4b)。氧过量培养的指数生长期在第7天停止，之后细胞密度维持为相对恒定的水平(图4a)。在此指数生长期的比生长速率(μ)为0.7d-1。但是，当氧耗尽培养时溶氧压力由于搅拌级联反应的限制而在第4天达到0时，此培养物从其指数生长期转为相对缓慢的生长(μ＝0.15d-1)，持续到第12天(图4b)。用EpoK-菌株在氧耗尽条件下培养，以及用能产生新的埃博霉素类化合物的其它经遗传工程改造的黄色粘球菌菌株进行培养，也观察到类似的生长行为模式和最大细胞密度的增加。
在氧耗尽培养条件下细胞密度的增加可能归因于(i)在因氧限制而强加的缓慢生长期间，细胞可能以不同的速率或不同的选择模式利用养分，从而推迟了关键养分的耗尽；(ii)在氧限制过程中，培养物可产生不同类型或水平的潜在性抑制生长的代谢物，与氧过量条件下分泌的不同；或(iii)氧限制增加或压制了参与细菌生长和呼吸过程的基因的表达和酶的活性。
培养细菌培养物过程中控制溶氧浓度可对培养物的细胞密度和次级代谢物滴度及其同属物分布产生显著的影响。这种氧限制性培养策略可用于生产氧依赖性裁剪途径中的中间产物，作为主要产物。但是，单加氧酶活性不能完全被消除，而仅仅被减少到通常在氧过量条件下看到的最大速率的一部分。为了防止这些中间产物仍旧以缓慢的速率被加工，可能需要它们以一些方式稳定化。这方面的一个例子是EryK羟化酶和红霉素D底物的EryG甲基化酶间的竞争性反应(图1)。如果EryK活性下降，EryG则能够催化红霉素D转化成红霉素B，后者是EryK羟化酶的一种差的底物。这将产生该酶途径中间产物——红霉素B的积累。此途径还包括另一样氧依赖性裁剪酶EryF(如1)，该酶在限制性氧条件下保持了将6-脱氧赤酮酸内酯B(6-dEB)加工成红霉素B的能力。
这种中间产物积累的另一例子是具有活性EpoK酶的异源黄色粘球菌系统培养过程中埃博霉素D的产生。氧耗尽EpoK酶活性的下降显然足以减缓催化埃博霉素D中间产物转变成其埃博霉素B同属物，并使埃博霉素D扩散出细胞，被生物反应器中的XAD-16树脂结合和固定。已显示，在没有树脂存在时，将埃博霉素C和D加到保留EpoK活性、但是为非生产性的纤维堆囊菌菌株的摇瓶培养物中将导致这些化合物扩散回细胞中，并转化成埃博霉素A和B.Julien及其合作者发现，使用其埃博霉素PKS为非功能性、但EpoK活跃的黄色粘球菌菌株也存在相同的情况。
使用其埃博霉素聚酮化合物合成酶序列被操纵的菌株生产新的埃博霉素类化合物(Julien等，2000；Tang等，2000)。调节溶氧压力，并与将特异性前体如乙酸盐(acetate)、丙酸盐(propionate)加到生产培养基中相结合，将允许四种主要埃博霉素同属物A、B、C或D中的每一种的生产(图2，Frykman等，2002)，作为具有活性EpoK酶的单个黄色粘球菌菌株的主要产物。
增加生产培养基中丝氨酸浓度将增加其被埃博霉素非核糖体肽合成酶(NRPS)掺入埃博霉素中替换半胱氨酸的相对程度(Frykman等，2002)。向K111-32.25株和生长培养基中补充丝氨酸，以及调节溶氧浓度，将导致噁唑埃博霉素G2或H2的产生，作为主要产物(图2)。除了控制溶氧压力外还将丝氨酸、乙酸盐和/或丙酸盐补充到生长培养基中，则可积累八种噻唑和噁唑类主要化合物(埃博霉素A、B、C、D、G1、G2、H1和H2)的任一种，作为单一黄色粘球菌菌株的主要产物。这种方法还能使噁唑配对物10，11-二脱氢-埃博霉素D和Epo506得以生产和同属物调节。
已显示野生型埃博霉素PKS能生产除埃博霉素A-D外的大约35种其它的埃博霉素变体(Hardt等，2001)。类似地，已发现埃博霉素PKS和遗传工程产生的变体的异源表达产生了除预期产物外的大量新化合物。这些产物的浓度可根据通过调节培养条件而得到提高或被抑制。通过操纵在其PKS序列中具有单一遗传变化的菌株的培养条件而产生新化合物和调节其分布的能力证明，当与合适的生理学调节结合时，工具PKS的工程改造在快速产生具有强生物活性的新天然产物中可能发挥强有力的作用。
以上详细描述了本发明。给出下述实施例，这些实施例仅为阐述目的，不应认为这些实施例限制了本发明或权利要求书的范围。
实施例1调节氧压力条件下宿主细胞的培养细菌菌株。从纤维堆囊菌SMP44克隆得到埃博霉素聚酮化合物合成酶，将其导入黄色粘球菌DZ1株中(Julien等，在出版中)。黄色粘球菌的埃博霉素B生产者(K111-32.25)具有功能性EpoK环氧化酶(EpoK+)，但在埃博霉素D生产菌株(K111-40.1)中此酶已被遗传灭活(EpoK-)。通过在K111-32.25和K111-40.1株中导入点突变而消除埃博霉素PKS的烯酰基还原酶(ER5)结构域的活性，分别得到K165-79.7和K165.76.2株。将K165-79.7和K165.76.2株工程改造，分别产生10，11-二脱氢-埃博霉素B和D(图2)。
生物反应器接种扩增。所有的培养基组分从Sigma(St.Louis，MO)获得，除非另有说明。在28℃和175rpm，将1毫升存储瓶中的冷冻细胞加入含有3毫升CYE-MOM培养基〔10g/L的酪胨(酪蛋白的一种胰腺消化物，Difco，Detroit，MI)、5g/L酵母抽提物(Difco)、1g/L MgSO4·7H2O(EM Science，Gibbstown，NJ)和2mL/L的油酸甲酯(Emerest 2301，Cognis公司，Cincinnati，OH)〕的25毫升无菌玻璃管中恢复，从而开始所有的黄色粘球菌培养。在含有50毫升CYE-MOM的250毫升带有挡板的Erlenmyeyer烧瓶中扩增该试管中的全部内容物1天，然后，将此瓶中的内容物接种到2.8升带有挡板的Fernbach烧瓶中的500毫升CYE-MOM中，培养1天。
进料批次生物反应器培养。将100克XAD-16疏水性树脂(Eohm和Haas，Philadelphia，PA)和10克MgSO4·7H2O与4.5升去离子水混合，然后在5升生物反应器(B.Braun，Allentown，PA)中进行无菌处理(90分钟，121℃)。将该树脂加入生长培养基中，以结合埃博霉素和使它们稳定而不降解。将两个分离的进料回路与生物反应器连接，分别提供酪蛋白消化物和油酸甲酯的250g/L溶液，并向生物反应器加入足量的这两种营养成分，以使最初的酪蛋白消化物和油酸甲酯的浓度分别达到5g/L和2mL/L。最后，在无菌条件下加入25毫升经0.22微米滤膜无菌过滤的微量元素溶液〔1％(v/v)浓H2SO4，14.6g/LFeCl3·6H2O、2.0g/L ZnCl3、1.0g/L MnCl2·4H2O、0.43g/L CuCl2·2H2O、0.31g/LH3BO3、0.24g/L CaCl2·6H2O和0.24g/L Na2MO4·2H2O〕。然后在生物反应器中接种CYE-MOM种子培养物(5％v/v)，接种后的最初48小时加入酪蛋白消化物(2g/L/天)和油酸甲酯(3mL/L/天)。维持生物反应器中的气流恒定在0.4vvm(气流体积/容器体积/分钟)。
使用原位极谱法氧传感器监测生物反应器中溶氧压力。通过用100％氮气平衡生产培养基而在0％溶氧压力校准该探针，以及通过用空气平衡该生产培养基而在100％溶氧压力校准该探针。将最初的搅拌速率设定在400rpm，在培养过程中不使用额外的生物反应器背景压力。氧在28℃的饱和浓度大约为7.7mg/L(Pirt，S.J.，1975)。通过在氧过量培养中的搅拌级联而将溶氧压力维持在最小50％的空气饱和度(3.9mg/L O2)，在氧耗尽的培养中将搅拌速率限制在最大450rpm。通过自动加入2.5N H2SO4和2.5N KOH而将pH设定为7.4。每天对生物反应器采样，共12-14天，接着收获树脂。
细胞密度和埃博霉素滴度的定量测定。每天从生物反应器中取出50毫升的培养基样品，放到锥形试管中，将肉汤从树脂中倾清。将1mL等份的肉汤在1.5毫升eppendorf管中离心5分钟(12000g)，用移液管除去上清液。用去离子水再悬浮细胞沉积物，得到1毫升的总体积，用分光光度计(Genesys 20，Thermo Spectronic，Rochester，NY)在600nm测量该细胞悬液的吸光度。黄色粘球菌培养物生长成分散的单细胞棒状，这有利于精确的光密度(OD)测量。1.0吸光度单位的OD测量值与大约0.3g/L的干细胞重量相关，线性相关性的范围为0-40OD单位。
用45毫升去离子水洗涤XAD-16树脂一次，接着将水倾清。在25毫升试剂级甲醇中抽提树脂30分钟，然后采用HPLC或LC/MS定量测定埃博霉素的滴度。使用Hewlett Packard 1090 HPLC(Palo Alto，CA)作UV检测，在250nm进行HPLC分析。将50微升等份的甲醇抽提溶液注射通过两个4.6×10毫米规格的预柱(MetaChem Inertsil C18 ODS 3，5μm，Ansys，Lake Forest，CA)，另一较长的柱(相同材料)用作色谱分离(4.6×150毫米)。此方法用70％乙腈和30％水进行12分钟的等度(isocratic)洗脱。对相同的样品进行LC/MS分析，将样品注入PE Sciex API100LC(Perkin-Elmer，Shelton，CT)，使用APCI来源和与上述相同的预柱和色谱柱。色谱方法是用线性梯度从35％递增到100％的乙腈/水，时间为10分钟。
实施例2新埃博霉素类化合物的生产埃博霉素PKS已经基因工程改造，以产生本发明的能产生新埃博霉素类化合物的菌株，该化合物潜在地具有增加的水溶性和/或有力的抗肿瘤细胞系。将本发明的氧控制方法施用于经工程处理的黄色粘球菌生产菌株(K165-79.7株，EpoK+)，该菌株已被基因工程加工成生产新的埃博霉素——10，11-二脱氢-埃博霉素B(图2)。当其配对物K165-76.2(EpoK-)株在氧过量条件下培养时，发现10，11-二脱氢-埃博霉素C和D是唯一的产物(图2)。K165-79.7株中活性EpoK酶预期在氧过量存在下催化此10，11-二脱氢-埃博霉素D中间产物环氧化成10，11-二脱氢-埃博霉素B(图6a)。但是，此化合物没有被检测到，相反，一种新颖的异构体(Epo506)反而是这些培养的主要产物(图6b)。采用高分辨率质谱和一维、二维NMR确定这种四氢呋喃产物的结构(参见实施例1)。
所观察到的这种结果可能是一个过程的产物，籍此过程该10，11-二脱氢-埃博霉素B在这些氧过量条件下形成，然后被通过插烯Payne重排而被转化成Epo506，如图6所归纳的。这种反应是有利的，因为环氧化物被开环，产生了相对稳定的烯丙基碳阳离子中间产物。K165-79.7株在氧耗尽和氧过量条件下的培养导致10，11-二脱氢-埃博霉素D和Epo506之间的同属物比例的转移(图7)，这与在所述两种溶氧水平条件下培养亲代K111-32.25菌株所获得的环氧化的和未环氧化的埃博霉素化合物之间的同属物转移类似(表1)。
用装配有成阳离子状态的涡轮-离子喷射源的Mariner TOF分光计(AppliedBiosystems，Foster City，CA)获得了Epo506的高分辨率质谱图。在装备了QNPz-轴梯度探头(probehead)的DRX 400分光计(Bruker，Billerica，MA)记录300K处Epo506的1-D和2-D NMR谱图。化学漂移分别参见1H和13C光谱图的δ7.26和77.0。
采用HREIMS测定在m/z 506.25887(根据C27H40NO6S 506.25709计算)的[M+H]+峰值，测得Epo506的分子式为C27H39NO6，表明相对于10，11-二脱氢-埃博霉素D有一个氧掺入。13C光谱表明，Epo506具有一个双键，少于10，11-二脱氢-埃博霉素D，提示Epo506含有一个额外的环。HSQC、HMBC、COSY和TOCSY数据明确了碳的连接性排列。第3、7、10和13位碳的化学漂移表明所有这四个碳都结合有氧原子。这些氧化的碳中，推测有两个成为占据了该分子式的环醚的一部分。在1-D和2-D光谱中可看出碳3和13上的羟基质子，它们与相邻原子的HMBC和COSY相关性证实了它们的排列。因此，该环醚必须包括碳7和碳10，表明其为四氢呋喃结构。该质谱中显著的Na+和K+加合物也证实，LC/MS在506.3观察到的离子是真实的分子性离子，而不是推测的亲代二醇离子化后产生的片段。
表1.K111-40.1株中埃博霉素同属物的转移培养条件(菌峰值埃博霉峰值埃博霉总(A-D)埃博埃博霉素埃博霉素株，氧水平) 素B滴度素D滴度霉素滴度 B∶A同属物D∶C同属物(mg/L)(mg/L) (mg/L) 比率比率K111-32.25 48 3 60 5.8∶13.6∶1(EpoK+)氧过量K111-32.25 3 19 34 2.5∶11.7∶1(EpoK+)氧耗尽K111-40.10 30 36 - 5.2∶1(EpoK-)氧过量实施例3在纤维堆囊菌Soce90 K111-150.17株中调节埃博霉素同属物生产已显示，在异源宿主细胞培养过程中调节溶氧可转移聚酮化合物的同属物分布。在此实施例中，当在氧耗尽的条件下培养时，使产生埃博霉素的菌株接受导致埃博霉素同属物分布转移的氧压力。纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)Soce90 K111-150.17(ATCC保藏号＿＿＿＿)是通过UV诱变从Soce90亲代株衍生得到的利福霉素抗性变体(B.Julien，未公开的结果)。本实施例采用的培养方法和分析方法与实施例1所述的相同。
纤维堆囊菌Soce90 K111-150.17株是具有活性epoK基因的埃博霉素A和B的生产菌株。图8a阐述了随着时间推移的细胞生长，通过在三种不同的溶氧(DO)和气流(测量为1pm，即升/分钟)条件下在600nm测量光密度(OD)而获得。图8b显示溶氧调节对埃博霉素产物分布的影响。埃博霉素A和B的生产菌株——纤维堆囊菌Soce90 K111-150.17株在0％耗尽溶氧的条件下产生埃博霉素C和D。表2显示该K111-150.17株在不同氧压力条件下产生的观察到的埃博霉素滴度。对于K111-150.17株而言，在0％耗尽溶氧的条件下观察到的埃博霉素D的生产量比在50％过量溶氧条件下观察到的高几倍。
表2.K111-150.17株在氧耗尽条件下埃博霉素同属物比例的转移
图9显示K111.150.17株在三种不同的溶氧方案中产生埃博霉素A、B、C和D的时间过程，显示在低氧压方案中埃博霉素D具有较高的生产。在50％溶氧压力和0％溶氧压力下进行发酵所获得的发酵物的HPLC色谱显示，在50％氧压力下几乎唯一产生埃博霉素A和B，但在低氧压力先产生了较高量的埃博霉素C和D。
上述实施例仅仅是阐述性的。本领域技术人员会理解，它们并非是本发明的限制性实施例，如发明人在以下的权利要求书中所要求的那样。
权利要求
1.一种在受控的氧压力条件下培养的重组粘细菌宿主细胞，所述宿主细胞含有聚酮化合物合成酶(PKS)基因，该基因在表达控制序列的控制之下，其中，当所述宿主细胞在导致所述聚酮化合物产生的条件下培养时，所述PKS基因表达产生聚酮化合物，所述宿主细胞还含有编码有活性的氧敏感细胞色素P-450单加氧酶裁剪酶的基因。
2.如权利要求1所述的粘细菌宿主细胞，其特征在于，所述聚酮化合物是埃博霉素。
3.如权利要求2所述的粘细菌宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)K111-150.17株，所述氧敏感细胞色素P-450单加氧酶是EpoK环氧化酶。
4.一种将宿主细胞中埃博霉素聚酮化合物合成酶(PKS)中的乙酰转移酶(AT)结构域补充单元特异性从丙二酰-CoA改便为甲基丙二酰-CoA的方法，其特征在于，所述方法包括在能产生埃博霉素的条件下在生长培养基中培养所述宿主细胞，并将氧压力调节为过量的溶氧。
5.一种调节粘细菌宿主细胞中聚酮化合物同属物分布产生比例的方法，其特征在于，所述方法包括在能产生聚酮化合物的条件下在生长培养基中培养所述宿主细胞，并在培养所述宿主细胞的过程中调节氧压力，使所述聚酮化合物同属物的种类的产生发生转移。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给所述生长培养基补充丝氨酸。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给所述生长培养基补充乙酸盐。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给所述生长培养基补充丙酸盐。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚酮化合物是埃博霉素。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述氧压力调节为低氧压力，所产生的聚酮化合物同属物为埃博霉素D。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)，具有活性EpoK+单加氧酶。
12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)K111-150.17株。
13.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-32.25株。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在低氧压力下获得所述埃博霉素D同属物。
15.如权利要求10所述的方法，所述埃博霉素D同属物的浓度比在氧过量压力条件下产生的浓度高4倍。
16.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在氧耗尽培养条件下所述埃博霉素同属物从埃博霉素A和B转移成为埃博霉素C和D同属物分布。
17.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在氧过量条件下所述埃博霉素D与埃博霉素C同属物的比例至少为3∶1。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述粘细菌宿主细胞是EpoK-。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述粘细菌宿主细胞是黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-40.1株。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述氧压力为低于50％溶氧。
全文摘要
本发明提供一种通用的氧限制性培养方法，用于培养经基因工程改造的能在不同氧压力条件下异源表达聚酮化合物合成酶(PKS)基因簇的粘细菌菌株，调节聚酮化合物同属物分布。
文档编号C12N1/21GK1639319SQ03804528
公开日2005年7月13日申请日期2003年2月25日优先权日2002年2月25日
发明者P·J·利卡, B·朱利恩, S·弗吕克曼, H·斯路塔申请人:高山生物科学股份有限公司

文档序号 : 【 447251 】

技术研发人员：Ｐ.Ｊ.利卡,Ｂ.朱利恩,Ｓ.弗吕克曼,Ｈ.斯路塔
技术所有人：高山生物科学股份有限公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除

Ｐ.Ｊ.利卡丨Ｂ.朱利恩丨Ｓ.弗吕克曼丨Ｈ.斯路塔丨高山生物科学股份有限公司

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