利用芳香族硫醚配体分离的方法

2025-09-28 09:20:10 527次浏览

专利名称：利用芳香族硫醚配体分离的方法
技术领域：
本发明涉及将核酸分子，尤其是质粒与溶液中其它组分分离的方法。该方法利用芳香族硫醚配体来吸附核酸分子并提供了一种新的脱附吸附分子的方式，大大地提高了该方法的总的分离效率。本方法优选地为一种色谱方法。
背景技术：
在最近十年，向病人给药治疗基因已成为预防或治疗各种疾病的现实。通常在最大限度地减少病毒感染危险的临床应用中优选使用非病毒载体。这增加了对用于基因治疗的高度纯化质粒以及基于质粒的疫苗的需求。卫生管理机构提出的严格指南和规则要求用于临床应用的纯化超螺旋质粒DNA的均质制剂。
色谱法是用于小规模和大规模纯化超螺旋质粒DNA的方法(Ferreira，G.N.M.，Prazeres，D.M.F.，Cabral，J.M.S.，和Schleef，M.Plasmid manufacturing-综述。在Schleef，M.(Ed.)Plasmidsfor therapy and vaccinationWiley Wiley-VCHWeinheim，2001，p.193-236)。基于大小排阻、离子交换和疏水作用层析(HIC)的分离方法已被证明适于纯化质粒DNA(Ferreira，G.N.M.，Monteiro，G.A.，Prazeres，D.M.F.，和Cabra ，J.M.S.Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNAvaccine applications，TIBTECH 2000；18，380-388)。基于固定化的合成寡核苷酸与质粒DNA的一段序列之间的序列特异性作用的亲和层析，也已被建议使用(Schluep，T.，和Cooney，C.L.Purifi-cation of plasmids by triplex affinity interaction，NucleicAcids Research 1998；26，4524-4528)。然而，这些技术均不能产生用于非分析应用的充分量的超螺旋质粒DNA的均质制剂。
为了解决这个问题，过去人们努力致力于开发使质粒DNA切口形式的形成最小化的样品制备技术。然而，这种方法难以重复且因此产生的质粒DNA的品质不能满足终产品所需的严格要求(Levy，M.S.，0′Kennedy，R.D.，Ayazi-Shamlou，P.，和Dunnill，P.Biochemical engineering approaches to the challenges ofproducing pure plasmid DNA.Trends in Biotechnology 2000；18，296-305)。因此，发展一种显著减少最佳化上游过程的乏味努力的新的和稳定的分离超螺旋质粒DNA的方案已经成为一种公认的需求。
Oscarsson等人提出了用亲硫色谱法(Oscarsson，S.，和Porath，J.Covalent chromatography and salt-promoted thiophilicadsorption. Analytical Bio-chemistry 1989；176，330-337；Porath，J.，Maisano，F.，和Belew，M.Thiophilic adsorption-anew method for protein fractionation.FEBS Letters 1985；185，306-310)来纯化蛋白。在随后的专利申请WO95/33557中，Oscarsson和Porath公开了一种耐碱的蛋白吸附剂，其类似于1989年所讨论的，但其亲硫基团已与配体的其余基团距离远以提高在碱性环境中的特性。通过感胶盐的高浓度促进了蛋白质的吸附，且利用疏水作用层析(HIC)中常用的条件实现脱附作用，疏水作用层析是用另一种较少感胶的盐或仅仅用水代替该种感胶盐。
近年来，不同配体结构物包括硫醚在适用于大规模方法的条件下结合质粒DNA的不同同种型的能力已被人们所研究。这些公开在瑞典专利申请SE0101380.4中，然而在本申请登记的时候没有公开。因此限定“最佳配体”与超螺旋质粒DNA相互作用所需的特异性结构物以及对其选择性地纯化是可能的。结果，人们鉴定了一组新的亲硫配体，即芳香族硫醚，其有效地辨别质粒DNA的同种型。含有这些配体的基质已显示能从其同种型，即在单一色谱法步骤中的开环(oc)形式中有效地分离超螺旋(共价闭环(ccc))质粒DNA。因此，应用这些基质好象有可能且应该会促进用于基因治疗和DNA疫苗应用的高度纯化的超螺旋质粒DNA的生产。
然而，尽管质粒DNA可与其同种型分离，其它的问题仍需进一步的解决。例如，含有目的核酸的细胞溶解产物通常也包括一种或多种蛋白质，诸如酶，或各种降解产物。尽管以前所报道的方法基本上能够分离蛋白与目的核酸，但获得的分离度仍然不能充分地满足有效的生产过程的要求。包括脱氧核酸(DNA)的细胞溶解产物通常也包括核糖核酸(RNA)和一些残留的蛋白质。然而，在上述所讨论的上下文中，当质粒DNA是用于药用目的时，二者成为必须被除去的污染物。此外，质粒DNA的色谱纯化在大多数情况下导致内毒素即宿主细菌的膜组分的共纯化，而内毒素毫无疑问是必须要被除去的以满足药用产品的严格要求。因此，人们需要改进现有的利用亲硫色谱法分离核酸和上述污染物的纯化方案。
本发明的概述本发明的一个目的是提供一种利用含有一种或多种芳香族硫醚配体的基质从溶液中分离核酸，诸如DNA的可选择的方法。这个目的和其它的目的可通过附加的权利要求书所公开的方法来实现。
本发明的更具体的目的是提供一种使与基质结合的分子脱附的方法，该方法提供了质粒与一种或多种不希望得到的组分，诸如蛋白质、RNA和/或内毒素的更有效的分离。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的脱附方法，其也能够将不同的质粒同种型彼此分离，更具体地分离ccc质粒DNA与oc质粒DNA。
定义此处应用的术语“蛋白质”包括全部蛋白以及部分或痕量蛋白及其它含有肽结构的分子。
此处所用的术语“核酸分子”与术语“核苷酸”同义且包括DNA，例如质粒，诸如开环(oc或切口的)质粒DNA，超螺旋(ccc)质粒DNA及其它DNA，诸如基因组DNA，以及RNA，诸如mRNA，tRNA和sRNA。
短语“让溶液/洗脱液流经基质”是指任意的让基质与溶液或洗脱液接触且在特定的一段时间后将其去除的方式。因此，该术语包括动态层析法以及批次方法。
此处所用的术语“洗脱液”为在色谱法中的常规含义，即一种能够干扰固相(吸附基质)和产物(核酸分子)之间相互作用并促进产物从固相选择性地解离的溶液。
术语“感胶的”是影响溶剂中疏水的相互作用特性的离子能力的大小。
附图的简要说明

图1显示了具有分离特性且因此对于本发明是有用的芳香族硫醚配体的实例。
图2显示了碱溶解产物的组分离导致质粒DNA和RNA组分分离后获得的色谱图。
图3a-d显示了通过对插入物中描述的配体进行层析后获得的结果。图3e显示了通过对芳香族硫醚配体进行层析后获得的样品进行激光诱导的荧光毛细管凝胶电泳后的电泳图谱。
图4是说明结合在芳香族硫醚配体上的澄清的碱溶解产物以及不同的核酸组分的洗脱色谱图。
图5是描述通过对芳香族硫醚配体进行层析之后的质粒DNA、RNA以及脂多糖的分布图。
图6显示了通过对芳香族硫醚配体进行免疫球蛋白层析之后获得的结果。
图7是说明通过增加KCl梯度洗脱质粒DNA的色谱图。
图8是显示利用Na2SO4作为感胶盐通过芳香族硫醚配体来纯化质粒DNA的色谱图。
图9显示了说明当比较渐减的盐洗脱(附图9a)与渐增的盐洗脱(附图9b)时内毒素分布的差别的色谱图。
本发明的具体描述更具体地，本发明的第一个方面是一种分离溶液中污染物与核酸分子的方法，该方法包括以下步骤(a)提供一种吸附水溶液，其含有核酸以及当溶解时形成感胶离子的盐；(b)让所述溶液流经基质使目的核酸吸附到该基质上，所述基质含有一个芳环部分和至少一个硫醚部分；(c)选择性地洗涤所述基质；(d)让水相洗脱液流经基质来脱附其中的核酸分子，该洗脱液除了含有形成感胶离子的盐之外，也含有来自于递增的盐浓度的递增的离子强度梯度，该盐在溶解时形成了比在吸附过程中呈现的离子的感胶性小的感胶离子；和
(e)分离含有所要核酸分子的组分。
在最优选的实施方案中，步骤(a)和(d)中所指的离子为各种盐溶解时所形成的阴离子。
本发明的方法可用于分离在细胞，例如重组细胞中表达的核酸分子。因此，其也包括破碎细胞来提供含有核酸分子的溶液的第一步骤。这种破碎可按照标准的方法通过例如裂解，诸如碱裂解法来进行(参见例如，Maniatis，T，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY)。因此，上述步骤(a)中提供的溶液优选地基本上不含细胞碎片。此外，本发明对于分析溶液中的核苷酸混合物即用于分析目的的分离也是有用的。
在本方法的有利实施方案中，按照步骤(e)分离的组分为质粒DNA，其基本上不含RNA。正如上述所讨论的，这是药物制备中的一个严格要求。如下述实验部分所显示的，在DNA洗脱过程中RNA与基质保持稳固地结合。如果需要，RNA然后可通过用水或低盐缓冲液洗涤基质被轻易地除去，例如用于基质的再生。然而，在一个可选择的实施方案中，本发明是一种从也含有DNA的溶液中回收RNA，例如用于科学研究的方法。这两个实施方案显示出出乎意料的优点，不仅核酸分子彼此分离，而且也与污染物诸如存在于溶液中的蛋白组分和内毒素相分离。如实验部分将要显示的，与本发明中所用的基质结合的蛋白在与核酸不同的阶段被洗脱，且因此可收集在一个分离的组分中。
本发明表明了通过利用从含有芳香族硫醚配体的基质洗脱的新原理来分离两个蛋白组分以及将细胞溶解产物中的DNA和RNA分离是有可能的。此外，本方法也已被表明能有效地分离目的核酸分子与其它污染物，诸如内毒素。因此，本发明的方法在例如纯化用于基因治疗的核酸、DNA疫苗和与基因治疗相关的实验室研究方面是有用的。在一个有利的实施方案中，本发明的方法将提供可接受的基因治疗级的分离的超螺旋质粒DNA。如上所述，以前描述的用于分离此种载体的方法没有满足此目的。
在本方法的一个实施方案中，步骤(a)的溶液含有一种溶解的碱金属盐，诸如硫酸铵或硫酸钠。因此，吸附过程中存在的阴离子为强烈感胶的硫酸盐离子。在一个特异性实施方案中，所述盐的浓度低于大约3.0M，诸如大约为2.5M。本领域的技术人员能够认识到，上限取决于每种盐的溶解能力。然而，本领域的技术人员应能认识到，在不同的情况中要求不同的盐浓度，不仅取决于基质所应用的特异性配体，而且取决于待分离的核酸。吸附步骤中溶液的pH可不同于洗脱步骤中的pH。然而，为了确保待分离的核酸的稳定性，pH应保持在生理学的pH，即大约6.5-8.5的范围内。
在一个有利的实施方案中，已被吸附的所要核酸的基质在依照步骤(d)洗脱之前被进行洗涤。在洗涤过程中，松弛结合的污染物被除去。本领域的技术人员可以依照标准方法很容易地进行此种洗涤。
利用合适的水性洗脱液进行本发明的步骤(d)，其除了具有形成感胶离子的盐之外也包括递增的离子强度的梯度，例如一个连续梯度。然而，为了某种目的如大规模生产超螺旋质粒DNA，人们也许希望利用逐步的梯度。
步骤(d)所用洗脱液的递增的离子强度被通过洗脱液中盐的递增的浓度来提供，所述盐能够比溶于吸附溶液的盐形成较少的感胶离子，诸如阴离子。本领域的技术人员众所周知，离子的感胶特性可根据Hofmeister或感胶离子序来评价。溶解盐将逐步改变溶剂中的条件，本发明人发现此种改变对于脱附易分离的组分DNA和RNA是有用的。事实上，人们发现对于大多数的配体来说，仅仅通过添加水就将RNA作为最后的组分中洗脱下来。蛋白质和内毒素可仅仅通过添加水来除去，表明这些分子对基质仅仅有疏水结合机制，完全不同于核酸展开机制。在一个实施方案中，溶于洗脱液的盐是一种碱金属盐，诸如氯化钠或氯化钾。因此，较少感胶的阴离子是氯化物离子。在一个特异性实施方案中，盐的最大浓度大约为3M。然而，如上所述就溶于吸附溶液的盐来说，对于每一特异性配体和所要的核酸而言，可能需要一些常规实验来确定最佳条件。类似于吸附步骤，洗脱过程中的pH值应保持在其中核酸是稳定的范围之内。
因此，本发明基于出乎意料的发现，通过芳香族硫醚配体吸附于基质上的核酸可通过上述所讨论的递增的离子强度梯度被有效地洗脱。更具体地，该洗脱液除了增加的离子强度的梯度之外，还包括形成感胶离子诸如用于吸附步骤中的缓冲液的盐。这些与最近采用的芳香族硫醚配体基质，例如在上述讨论的WO95/33557中的完全相反，其中洗脱是通过从洗脱缓冲液中除去感胶盐来进行的。因此，在现有技术中，芳香族硫醚的洗脱是通过加入水溶液(其稀释感胶盐)或通过加入能代替该感胶盐的盐来进行的。换句话说，总的盐浓度在洗脱过程中被减少或保持在一个类似的值。然而，本发明人第一个表明了芳香族硫醚配体的洗脱可通过利用附加了渐增的离子强度梯度的吸附中所用的相同的缓冲液来进行。
至于本方法中利用的基质，其由下面具体讨论的与支持物通过硫醚键偶合的配体组成。每一基质可包括一种或多种的配体结构。
在一个实施方案中，所用的配体含有一个芳香族硫醚，其中芳基基团选自吡啶基、苯基、苯甲基、甲苯酰基、苯乙基、萘基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吲哚基、喹啉基以及嘌呤基基团。
在一个有利的实施方案中，吡啶基-S和/或苯基还含有芳基基团上的取代基，例如如图1中所示。
附着于形成本发明基质的载体材料上的配体可以是一个巯基-吡啶、巯基烷基吡啶。因此其是通过硫醚键附着于载体上的巯基基团。进一步，如上所述，配体的芳基基团形成部分可以是苯基、苯甲基、甲苯酰基、苯乙基、萘基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基。其它的取代基也可被添加到芳环上。通过提供具有其它取代基的芳香族硫醚配体，可设计大量不同的分离基质。取代基可例如是一个或多个胺基、硝基、醚基、硫醇基和/或卤素，例如氟。这些其它的取代基还可以进一步地包括碳原子，如需要的话。同样，本领域的技术人员可以认识到，在上述讨论的环状结构中碳原子可被杂原子取代。此处的术语“芳香族硫醚配体”应被理解为包括大量的可被取代到所要程度的化合物，其中的一些被举例说明在图1中。配体密度可以是10-500μmol/毫升载体，优选在10-100μmol载体的范围内。
本发明中所用的基质包括可以是与支持物偶合的一个相同或不同的化学结构的配体。支持物可以为任意合适的形式，诸如基本上球状的颗粒、膜、滤纸、微量滴定板等等。支持物可以是任意合适的，众所周知的无机或有机材料。
无机支持物材料的实例为玻璃、硅石或其它惰性的颗粒状矿物质。有机支持物的实例为琼脂糖、右旋糖酐、二乙烯基苯等等。许多可利用的市售的产品基于不同的树脂或聚合物，例如琼脂糖或交联的琼脂糖(诸如琼脂糖TM，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、右旋糖酐(诸如SephadexTM，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、聚苯乙烯/二乙烯基苯(MonobeadsTM，SOURCETM，AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)、包被的聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、右旋糖酐丙烯酸聚合物(SephacrylTM，amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、乙烯接枝聚合物或乙烯聚合物，基于硅石的不同树脂诸如硅石-右旋糖酐、硅石-丙烯酸聚合物以及硅石-聚乙烯亚胺。在一个有利的实施方案中，基质是交联的琼脂糖，其例如利用环氧基活化可以被配体功能化。
本发明的方法可以用以膨胀床或填充床的形式排列的基质来实施，且可以是动力学的即层析分离或以批次的方式进行。在填充床吸附中，基质被填充在色谱柱中且所有在纯化过程中使用的溶液流过，通常以相同的方向流经柱。然而在膨胀床吸附中，通过让液体流过柱，通过通常从下面施加液体流通过柱来使基质膨胀和平衡。当在应用样品和洗涤步骤过程中在粒子沉降或上升速率和流速之间有一种平衡时，形成了稳定的流化膨胀床。在膨胀床的洗脱步骤中，基质被沉淀且表现如同一种填充床的基质。
在一个实施方案中，基质粒子的平均大小在大约10-300μm的范围内，例如，在10-20、20-50、50-100、100-200或200-300μm的范围内。然而，粒子可以被有利地制备为用于有效的市售滤网筛子设备的任意大小，诸如250、212、180、150、125、106、90、75、63、45、37、30、25、20、15μm。
附图的详细说明图1显示了各种与琼脂糖TM6速流(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)反应的芳香族硫醚化合物的实例。如此附图所显示的，芳香族硫醚化合物可以具有不同的取代基，每一个都可以产生能证明有利于不同目的的结合和洗脱的特性。
图2说明了质粒DNA的制备。将碱溶解产物加载到在2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCI，pH7.0中预处理的琼脂糖TM6速流(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)柱中。在30cm/h下层析后，质粒DNA被与RNA分离开。此外，质粒DNA可立即收集在缓冲液中用于进一步的亲硫芳香族层析分离实验。
图3a和3b说明了通过用本发明的芳香族硫醚配体在不同的柱上纯化超螺旋质粒DNA。如图2所述制备质粒DNA样品并加载到用2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-Cl，pH7.0预处理的柱中。用在相同缓冲液中的2M NaCl的梯度获得了超螺旋质粒DNA的脱附。在这些条件下，开环质粒DNA不与基质结合，而超螺旋质粒DNA结合且可通过渐增的NaCl-浓度洗脱。图3c和3d为类似配体的比较实例，其然而，要么不是芳香族(附图3c)，要么没有硫醚的存在(附图3d)。实验使用与图3a和3b中相同的样品和缓冲液进行。从色谱图可清楚地看出这些最后提到的配体都不适合图3a和附图3b描述的层析分离类型。图3e描述了在对类似于附图3a的实验中获得的样品进行激光诱导荧光毛细管凝胶电泳后的电泳图谱。通过芳香族硫醚配体，质粒DNA的开环形式没有保留，而质粒的超螺旋形式被吸附并在线性梯度的早期被洗脱。
图4说明了碱溶解产物对亲硫芳香族层析基质的吸附及解吸附。用4M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCI，pH7.0稀释澄清的碱溶解产物样品来获得终浓度为2.25M的(NH4)2SO4，。在2.25M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mMTris-HCI，pH7.0，所有的核酸分子均吸附于基质。然而不同核酸的脱附是不同的。质粒DNA的同种型可通过2.25M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液(以较高放大率加入)中的3M NaCl的梯度来分离，而RNA仅仅用较少的(NH4)2SO4梯度就可从基质洗脱，结果产生了不同类型核酸分子的完全和有力的分离。
图5描述了质粒DNA和脂多糖(LPS)之间的分离。质粒DNA用RNA和荧光LPS掺料并加载于2-巯基吡啶琼脂糖TM6速流柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上，用2.25M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0平衡。质粒DNA同种型是通过将平衡缓冲液中的电导梯度增加到3M NaCl进行洗脱的，而RNA和LPS的洗脱通过将电导梯度减少到水来进行。
图6显示了免疫球蛋白如何可吸附于在1.0M(NH4)2SO4，10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0中的2-巯基吡啶琼脂糖TM6速流柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上。然而它们不能通过用NaCl增加电导来洗脱。为了脱附蛋白质，电导率应通过降低(NH4)2SO4-浓度来减小。这些表明存在疏水结合原理，不同于核酸分子与本发明所用的芳香族硫醚型配体的结合机制。
图7表明了其它用于洗脱质粒DNA分子的盐可代替NaCl。如附图2中所制备的将质粒DNA加载在2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0中的2-巯基吡啶琼脂糖TM6速流柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上并用在加样缓冲液中梯度洗脱到1M KCl。
图8说明了如何将质粒DNA加载在用3.0M Na2SO4，10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.0预处理的柱中并在用于预处理的缓冲液中梯度洗脱到1M NaCl。因此，附图证明了用于将核酸分子结合到亲硫芳香族色谱基质的疏水盐的替换。
图9a和b说明了当利用递减的或递增的盐浓度从本发明的芳香族硫醚配体上洗脱的内毒素分布的差异。将如附图2中制备的质粒DNA加载在2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0下的2-巯基吡啶琼脂糖TM6速流柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上，然后在加样缓冲液中梯度洗脱到1M KCl。因此将超螺旋质粒DNA梯度洗脱到水(附图9a)或到2M NaCl，2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0然后到水(附图9b)。利用标准的LAL-试验来测定一些组分的内毒素的含量。从实验可清楚地看出，当减少电导率时大部分的内毒素被洗脱。因此，超螺旋质粒DNA被优选地通过增加传导率来洗脱。通过此方式，超螺旋质粒DNA被洗脱并可被收集而不与内毒素一起共洗脱。
实验部分下面将通过实施例的方式来公开本发明，其仅仅用于说明的目的且不应被理解为对如附加的权利要求书所定义的本发明的限制。下面所提及的或本申请其它地方的所有的参考文献均通过参考文献引入。
层析介质原型将所有的配体(图2a到2d中的插入物)通过已知的方法偶合于环氧基活化的琼脂糖TM6速流柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)(Hermanson，G.T.，Mallia，A.K.& Smith，P.K.Immobilised affinity ligand techniques.Academic PressLimited，London，1992，p.51-132)上。配体浓度被选择为过量的，超过有效的结合部位且洗涤后，通过元素分析(硫或氮)检查偶合配体的量。
质粒DNA由具有代表蛋白A的部分插入序列的pUC19质粒(在这里插入物的同一性是不重要的)组成的6125个碱基对的质粒被用于此研究。通过已确立的方法，质粒被转染并在E.coli TG1α中生长(Sambrook，J.，和Russel，D.W.Molecular cloninga laboratory manual，ColdSpring Harbor，New York，2001)。根据Horn等人的方法(Horn，N.A.，Meek，J.A.，Budahazi，G.，和Marquet，M.Cancer genetherapy using plasmid DNApurification of DNA for humanclinical trials.Human Gene Therapy 1995；6，565-573)制备澄清的碱溶解产物。粗的质粒DNA制品(含有开环的和超螺旋同种型两种)被制备并应用在附图2中。
将1升的澄清的碱溶解产物以30cm/h加载于装填在INdEX 100柱(Amersham Bio-sciences)上的琼脂糖6速流柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)以便将缓冲液改变为在10mM EDTA，100mM Tris-HCI，pH7.0中的期望的SO42-浓度(在图3，7和9中为2.0M(NH4)2SO4；在图4和6中为2.25M(NH4)2SO4；在图8中为3.0MNa2SO4)。同时，此方法也除去了RNA和其它的污染物(没有显示)。
色谱方法用KTATM探索者(Amersham Biosciences)以75cm/h进行柱层析。将样品加载于以在10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0中的合适的SO42-浓度预处理的柱上(在图5中为1.0M(NH4)2SO4；在图3、7和9中为2.0M(NH4)2SO4；在图4和6中为2.25M(NH4)2SO4；在图8中为3.0M Na2SO4)以及在相同的缓冲液中梯度洗脱到盐(在图3a-d中为2M NaCl，在图4、5、6、8和9b中为3M NaCl，在图7中为1M KCl)或洗脱到在10(附图3，5和6)或5(附图4，7，8和9a-b)柱体积的水(附图9a)。在图4、5、6、8和9b中，盐梯度继之以水梯度来完全除去污染物。
荧光脂多糖为了评估层析法中内毒素的洗脱分布图，在5ml的包含不同质粒DNA的同种型的样品中掺入RNA和2.5μg/ml的荧光标记的来自大肠杆菌的10,000Da的脂多糖同种型(同种型055:B5，Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)。收集组分并根据厂商的说明记录荧光。
分析方法图4和5中的峰1、2、3和4被通过其260nm/280nm的吸收比率和在1％琼脂糖凝胶电泳上的电泳迁移图以及溴化乙锭染色鉴定分别为非核酸、开环的质粒DNA、超螺旋质粒DNA和RNA(Sambrook，J.，和Russel，D.W.Molecular cloninga laboratory manual，ColdSpring Harbor，New York，2001)(没有显示)。
利用标准的LAL-试验根据厂商的说明测定内毒素的值。
如Schmidt等所述的方法进行激光诱导的荧光毛细管凝胶电泳(Schmidt，T.，Friehs，K.，and Flaschel，E.(2001)Structuresof plasmid DNA，在M.Schleef(Ed.)“Plasmids for therapyand vaccination”，pp.29-43，Wiley-VCH，Weinheim)。
权利要求
1.一种分离溶液中的核酸分子与污染物的方法，其包括下列步骤(a)提供一种吸附水溶液，其含有核酸以及当溶解时形成感胶离子的盐；(b)让所述溶液流经基质以使所要的核酸吸附到该基质上，所述基质含有一个芳环部分和至少一个硫醚部分；(c)任选地洗涤基质；(d)让水性洗脱液流经基质来脱附其中的核酸分子，该洗脱液除了包含形成感胶离子的盐之外，也含有来自于渐增的盐浓度渐增加的离子强度梯度，该盐在溶解时形成了比在吸附过程中呈现的离子的感胶性小的感胶离子；和(e)分离含有所要的核酸分子的组分。
2.根据权利要求1的方法，其中所分离的组分是质粒DNA，其基本上不含蛋白质组分和/或RNA和/或内毒素。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)和(d)中所引用的感胶的和较小感胶的离子是由各自的盐形成的阴离子。
4.根据前述任意一项权利要求的方法，其中步骤(a)中所述的盐为硫酸铵或硫酸钠。
5.根据权利要求4的方法，其中在吸附溶液中的所述盐浓度低于大约3M。
6.根据前述任意一项权利要求的方法，其中溶于洗脱液中的所述盐为一种碱金属盐，诸如氯化钠或氯化钾。
7.根据权利要求6的方法，其中在洗脱液中的所述盐的最大浓度为大约3M。
8.根据前述任意一项权利要求的方法，其中所述基质由已与一种芳香族硫醚配体偶合的载体组成，其中该配体的芳基基团选自由吡啶基、苯基、苯甲基、甲苯甲酰基、苯乙基、萘基、咪唑基、吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吲哚基、喹啉基和嘌呤基组成的组。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的配体已通过硫醚部分与载体偶合。
全文摘要
本发明为一种将核酸分子，尤其是质粒DNA与溶液中的污染物，诸如蛋白质分离的方法，该方法包括下列步骤，(a)提供一种吸附水溶液，其含有核酸以及当溶解时形成感胶离子的盐；(b)让所述溶液流经基质使所要的核酸吸附到该基质上，所述基质含有一个芳环部分和至少一个硫醚部分；(c)任选地洗涤基质；(d)让水相洗脱液流经所说的基质来脱附其中的核酸分子，该洗脱液除了含有形成感胶离子的盐之外，也含有来自于渐增的盐浓度渐增的离子强度梯度，该盐在溶解时形成了比在吸附过程中呈现的离子的感胶性小的感胶离子；和(e)分离含有所要的核酸分子的组分。
文档编号C12N15/09GK1639336SQ03804384
公开日2005年7月13日申请日期2003年2月14日优先权日2002年2月21日
发明者R·莱门斯申请人:阿默森生物科学有限公司

文档序号 : 【 447250 】

技术研发人员：R.莱门斯
技术所有人：通用电气健康护理生物科学股份公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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R.莱门斯丨通用电气健康护理生物科学股份公司

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