利用切割剂扩增核酸片段的制作方法
发明
背景技术：
领域本发明涉及分子生物学领域，更特别地涉及包括核酸的方法和组合物，且更加特别地涉及利用切割剂(nicking agent)扩增核酸片段的方法和组合物。
相关技术描述通过人类基因组计划(Human Genome Project)获得的80,000～100,000个人类基因中每一个的染色体作图和核酸序列提供了鉴定负责遗传疾病的核苷酸座位的广泛方法的可能性。150-200种普通的遗传疾病和约600-800种较稀有的遗传疾病中的多数是与一个或多个缺陷基因相关的。在其中，已知超过200种人类疾病是由单个基因中的缺陷导致的，这经常导致单个氨基酸残基的改变。(Olsen，“BiotechnologyAn Industry Comes of Age”(National AcademicPress，1986))。
体细胞中发生的突变如果影响了涉及细胞分裂控制的基因时可诱导疾病，从而导致如肿瘤形成。在种系中，许多基因中的功能丧失型突变可导致人类中可探测的表型。雄性种系中从一个配子到后代中的一个配子时种系中的细胞世代数比雌性中的多大约20倍。在雌性中，卵子是在第二次减数分裂之后形成的并持续40年。因此不同类型种系突变和染色体畸变的发生率依赖于亲本来源。
种系或体细胞的大部分突变对于生物体具有很小的影响，这是因为基因组的大部分是缺乏编码功能的(约94％)。即使在外显子区域中也对突变有一些耐受性，这是由于遗传密码的简并性及因为氨基酸替代可仅对蛋白质功能具有轻微的作用。(参见如Strong等人，NewEngland Journal of Medicine 3251597(1991))。随着用于在大的DNA区段中探测突变的日益有效的方法的发展，对预测突变的功能结果(如临床表型)的需要变得更加重要了。
分子遗传学技术尚未以显著的程度应用于遗传和恶性疾病中染色体畸变的诊断；细胞遗传学仍然是研究这些重要的遗传机制的优选技术。在具有肿瘤抑制基因的一个突变拷贝的个体中，每103-104个细胞中就有一个细胞其剩余正常等位基因可被第二个拷贝的突变等位基因替代。导致该替代的机制包括染色体不分离、有丝分裂重组和基因转变。相反，破坏剩余基因拷贝的功能的独立突变估计发生于106个细胞中的一个细胞。
敏感性突变探测技术提供了用于突变筛选的异常可能性。例如，即使在受精卵植入之前也可进行分析。(Holding等人，Lancet 3532(1989))。日益有效的遗传检验也允许从与健康体检有关的呼吸道或膀胱中剥落的细胞中筛选致癌突变。(Sidransky等人，Science252706，1991)。可选择地，当未知基因导致遗传疾病时，监控DNA序列变体的方法对于通过遗传连锁分析研究该疾病的遗传是有用的。尽管有这些在单个基因中探测突变的独特应用，实现这种应用的现有方法学继续引起技术上和经济上的挑战。尽管已经寻求了几个不同的方法，但没有一个是充分有效的且对于大规模应用是成本有效的。
在限定的核苷酸座位探测突变的常规方法包括在家族中用有限的遗传标记组进行耗时的连锁分析，其中这些遗传标记是难以“读出(readout)”的。这种方法包括如DNA标记单倍型方法(可鉴定具有受影响的基因的染色体)以及用于探测较大的重排如大的缺失、重复、转位和单碱基对突变的方法。这些方法包括扫描、筛选和基于荧光共振能量转移(FRET)的技术。(参见Cotton，“Mutation Detection”(Oxford University Press，1997))。
探测低丰度突变的高灵敏性测定依赖于PCR以扩增目标序列。然而，这些测定却遭受与PCR试剂相关的高成本的限制。此外，探测和/或表征含有突变的扩增核酸片段的现有方法没有充分发展以使得能够对遗传变异进行高程度的多元鉴定。
部分由于探测遗传突变的现有方法学中的缺点，一直需要快速且灵敏地对目标核酸的限定核苷酸座位探测突变的方法。本发明通过提供在目标核酸的限定核苷酸座位探测突变的方法而满足了该需要及其他相关的需要，该方法还展示了增加的速度和方便性以及降低的成本。如在下文中详细公开的，本发明的方法基于用切割剂在限定的位置扩增含有遗传变异的核酸片段。此外，本发明也提供了方法和组合物以用于探测生物学样品中特定核酸的存在与否；用于制备单链核酸探针；以及用于探测在mRNA分子或cDNA分子中两个外显子之间连接(junction)的存在与否。
发明概述在一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括(a)使模板核酸分子与切割剂(NA)接触，其中模板核酸分子(“模板”)包括可由NA识别的切割剂识别序列(NARS)。在一个实施方案中，模板是部分双链的，其中在一个实施方案中NARS是在模板的单链部分，而在另一个实施方案中NARS是在模板的双链部分。在另一个实施方案中，模板是完全双链的。(b)如果模板不包括可由NA切割的切割位点(NS)，那么该方法提供模板一条链的延伸从而使得形成模板的延伸产物，而该延伸产物包括可由NA切割的NS。(c)在NS切割模板或其延伸产物。这将在NS提供3’和5’末端。如下文描述的，多拷贝的在切割位点具有5’末端的核酸片段将通过下面的步骤进行制备。(d)在NS从3’末端延伸步骤(c)的切割产物。(e)重复步骤(c)和(d)以扩增单链核酸片段。在本发明的各个实施方案中，该单链核酸片段具有不超过50或45或40或35或30或25或24或23或22或21或20或19或18或17或16或15或14或13或12或11或10或9或8或7或6或5或4或3或2或1个核苷酸。通常，形成具有不超过50、45等的核苷酸的单链核酸片段相对于形成具有超过50、45等的核苷酸的片段是有利的，这是因为至少下面的原因片段形成的速率和效率是较高的，较小的片段更容易由一些表征方法表征到较高的区别水平，该方法如质谱分析法和液相层析，且延伸步骤可用不必具有链置换活性的DNA聚合酶来进行。
下面的标准是可用于进一步描述本发明的方法的额外标准的例子。任何如在此处所公开的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个等标准(包括下面的标准)可组合起来描述本发明的方法。当两个标准(A和B)相互不一致时，它们可组合在可选择的方法中，即该方法可描述为包括标准A或标准B。这些标准包括NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是限制性内切核酸酶(RE)；步骤(c)是在选自下列DNA聚合酶的DNA聚合酶存在时进行的，而对潜在的DNA聚合酶的列表可进行缩减从而包括下面DNA聚合酶的任何2个、3个、4个、5个、6个、7个等exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，如步骤(c)可在选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶存在时进行；步骤(b)、(c)、(d)和(e)中的两个或多个，优选地为3个或4个且更优选地为所有4个均是在相同的等温条件下进行的；该方法包括表征步骤(e)中扩增的单链核酸片段的步骤；该方法包括由一种或多种方法表征步骤(e)中扩增的单链核酸片段的步骤，所述一种或多种方法选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、电子电离、凝胶电泳和毛细管电泳，例如该方法包括用质谱分析法(即用质谱分析法本身或包括质谱分析法的方法)表征步骤(e)中扩增的单链核酸片段的步骤；模板核酸具有位于NS的3’的遗传变异，并且该遗传变异与NS位于同一单链上，从而该遗传变异整合入扩增的单链核酸片段中；模板核酸可由包括下面步骤(i)和(ii)以及进一步可包括步骤(iii)的方法形成(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，而目标核酸包括要研究的遗传变异，其中如果(a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，然而，如果(b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和RERS两者的片段。该方法可选择地包括(iii)用识别RERS的限制性内切核酸酶切割步骤(ii)的延伸产物；模板核酸可由包括下面步骤(i)和(ii)的方法形成，如下(i)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中如果(a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(ii)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产具有第一个和第二个RERS两者的片段；模板核酸可由包括(i)和(ii)的方法形成，如下(i)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中如果(a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；而在每一种情况下，第一个和第二个ODNP各自进一步包含NERS的有义链的序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段；模板核酸分子进一步在含有NS的链中包括5’突出端，其中突出端包括至少基本与目标核酸互补的核酸序列；模板核酸分子进一步在不含有NS的链中包括3’突出端，其中突出端包括至少基本与目标核酸互补的核酸序列；在模板含有突出端的情况下，本发明可选择地进行下面的额外步骤(i)、(ii)和(iii)(i)在一定条件下使模板核酸与生物学样品中的核酸分子混合，而生物学样品可能含有目标核酸，该条件为当目标核酸存在于生物学样品中时，它可与模板核酸的突出端进行杂交。(ii)在进行步骤(a)之前从步骤(i)的混合物中去除未杂交的模板核酸。(iii)组合杂交的模板核酸与NA；双链模板核酸分子包括IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；双链模板核酸是以某种方式使核酸连接物与双链目标核酸进行连接而提供的，从而(i)根据本方法形成的扩增的单链核酸分子包括目标核酸的一部分，(ii)核酸连接物包括IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(iii)核酸连接物在不与含有NS的模板链连接的连接物链上包括NARS，(iv)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于(a)双链目标核酸片段和(b)相应于NS的位置的5’；模板核酸包括位于NS的3’的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接，从而在连接两边的与连接邻近的核苷酸可整合入扩增的单链核酸片段中；模板核酸是由包括如下(i)和(ii)的方法形成的(i)使第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和cDNA混合，其中第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A的反义链的部分互补的序列，第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B的有义链的部分互补的序列，且第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包括切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。(ii)延伸第一个ODNP和第二个ODNP以提供包含第一个ODNP和第二个ODNP的模板核酸；有时在步骤(e)之前，模板核酸可固定于固体支持体上，而在一个实施方案中不含有切割位点的核酸链附着于固体支持体上，可选择地为在该链的3’末端或可选择地在该链的5’末端附着，而在另一个实施方案中包括通过在NS进行切割形成的3’末端的核酸片段的5’末端附着于固体支持体上，而在另外一个实施方案中包括通过在NS进行切割形成的5’末端的核酸片段的3’末端附着于固体支持体上；例如，当将cDNA用于制备模板核酸时，则该cDNA分子可附着于固体支持体上；作为另一个例子，当将目标核酸用于制备模板核酸时，则该目标核酸可附着于固体支持体上。在相关的实施方案中，本发明提供了一种可用于探测cDNA分子中基因的上游外显子A(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的试剂盒，而该试剂盒包括至少一对如在此处所描述的探测方法中所使用的ODNP。此外，这些试剂盒可进一步包括，或者可进一步表征为包括一种或多种下面的成分/条件识别NARS的切割剂(NA)；限制性内切核酸酶(RE)；RE的缓冲液；切割性内切核酸酶(NE)；NE的缓冲液；N.BstNB I；第一个ODNP包含NERS和第二个ODNP包含RERS；第一个ODNP包含RERS和第二个ODNP包含NERS；RERS是IIs型限制性内切核酸酶可识别的；IIs型限制性内切核酸酶；IIs型限制性内切核酸酶的缓冲液；已知为Bpm I的IIs型限制性内切核酸酶；识别NERS的NE；DNA聚合酶；DNA聚合酶的缓冲液；exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶中的一种或多种；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B；一种铵盐，其胺成分选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺；与有机酸复合的仲或叔胺，且有机酸选自乙酸、丙酸及其卤化形式；甲醇；乙腈；反相层析柱；海藻糖；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；寡核苷酸标准；和/或用于设计或定购ODNP对的软件存取码。
在另一方面，本发明提供了在目标核酸中限定位置鉴定遗传变异的方法，而遗传变异可为如单核苷酸多态(SNP)。例如，在一个实施方案中，该方法包括(a)提供一种模板核酸(“模板”)，该模板核酸包括目标核酸的一些或全部，且特别地包括在目标核酸的限定位置包含遗传变异的核苷酸序列。模板进一步包括切割剂(NA)的切割位点(NS)，而NS位于遗传变异的5’。模板可为部分或完全双链的。(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的NA存在时扩增单链核酸片段，该单链核酸片段具有包括遗传变异的核苷酸序列。该单链核酸片段具有通过在NS切割形成的5’末端。(c)表征单链核酸片段以借此鉴定遗传变异。在另一个实施方案中，本发明在目标核酸的限定位点鉴定遗传变异(该遗传变异可为如SNP)的方法包括(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列且可选择地包含RERS。b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个ODNP和第二个ODNP的延伸产物。(c)可选择地用识别RERS的限制性内切核酸酶消化步骤(b)中的延伸产物以生产消化产物。(d)用步骤(b)的延伸产物或步骤(c)的消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(e)表征步骤(d)的单链片段以在目标核酸中鉴定遗传变异。作为进一步的例子，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，而该遗传变异可为如SPN，该方法包括(a)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(b)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产具有第一个和第二个RERS两者的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个和第二个RERS的限制性内切核酸酶(RE)存在时扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段长度不超过35个核苷酸。(d)表征步骤(c)的单链片段以鉴定遗传变异。另一个方面，本发明涉及在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，而该遗传变异可为如SNP，该方法包括(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含两个NERS的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的一种或多种切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(d)表征步骤(c)的单链片段以鉴定遗传变异。在相关方面，本发明提供了在单链目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，该方法包括(a)形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，第二个ODNP包含至少基本与目标核酸互补链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互补的核苷酸的3’，第一个和第二个ODNP各自进一步包含中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，完整的IRERS是具有第一链和第二链的双链核酸且包含由可变识别序列(VRS)连接的第一个和第二个CRS，且第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和完整IRERS的片段，其中遗传变异位于VRS中。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(d)表征单链片段以鉴定遗传变异。在进一步描述需要CRS、VRS和IRERS的该方法中，可利用一种或多种下面的标准，而下面标准的任何两个或多个均可进行组合，且这些标准仅是在此处阐明的例示性标准单链目标核酸是变性的双链核酸的一条链；双链核酸是基因组核酸；双链DNA是cDNA；至少基本与目标核酸互补的第一个ODNP的核苷酸序列长度至少为12个核苷酸；至少基本与目标核酸的互补链互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度至少为12个核苷酸；第一个ODNP长度为15-85个核苷酸；第二个ODNP长度为15-85个核苷酸；第一个ODNP进一步包含至少基本与第一个CRS的3’末端的目标核酸互补的一个或多个核苷酸；第二个ODNP进一步包含至少基本与第二个CRS的3’末端的目标核酸互补的一个或多个核苷酸；所有步骤(a)～(d)均在单个容器中进行；IRERS可由选自Bsl I、Mwo I和Xcm I的限制性内切核酸酶识别；NERS可由N.BstNB I识别；步骤(d)至少部分是通过用选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振、电子电离、凝胶电泳和毛细管电泳的技术进行的。
在限定位置鉴定遗传变异的这些方法的每一个(包括遗传变异是SNP的方法)可根据本发明由下面标准的一个或多个进行进一步的描述，而下面标准的任何两个或多个可进行组合以描述任何方法，且这些标准仅是例示性的，其他标准也可用于进一步描述根据本发明在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法遗传变异是单核苷酸多态(SNP)；遗传变异与疾病相关；遗传变异与人类遗传疾病相关；遗传变异与病原微生物的药物抗性相关；目标核酸是基因组核酸；目标核酸是cDNA；目标核酸源自病原病毒的基因组；目标核酸源自病原细菌的基因组；目标核酸源自病原细菌的附加体；NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；扩增是在等温条件下进行的；扩增是在50℃-70℃的温度范围内进行的；扩增是在60℃进行的；扩增是在55±5℃进行的；扩增是在60±5℃进行的；扩增是在65±5℃进行的；扩增是在70±5℃进行的；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高20℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高15℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高10℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高5℃之内；扩增是在DNA聚合酶的存在下进行的，而DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的任何一种，且这些DNA聚合酶的任何两个或多个可形成所述的可用于扩增的DNA聚合酶组，如DNA聚合酶选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶；单链核酸片段是由选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振和电泳的一种或多种技术进行表征的，如单链核酸片段是由一种或多种包括液相层析的技术进行表征的，或者如另一个例子，单链核酸片段是由一种或多种包括质谱分析法的技术进行表征的，或者如另外一个例子，单链核酸片段是由一种或多种包括液相层析和质谱分析法两者的技术进行表征的；当方法包括使用引物即ODNP时，在本发明的各个实施方案中，方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；当本发明的方法包括使用引物即ODNP时，那么在本发明的各个实施方案中，方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地不超过50个、或不超过45个、或不超过40个、或不超过35个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个核苷酸；当方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地为至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；当本发明的方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由II型限制性内切核酸酶识别；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由IIs型限制性内切核酸酶识别；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由Bpm I识别；当本发明的方法需要使用含有一种或多种RERS的核酸分子时，或者该方法需要使用各自具有RERS的一个或多个分子时，那么在各个实施方案中RERS可由选自Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind II和Nci I的RE识别，而从这些Re的任何两个或多个中可形成一个组；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由间断的限制性内切核酸酶识别；当方法包括两个RERS时，那么在一个实施方案中第一个RERS的核苷酸序列不与第二个RERS相同，而在另一个实施方案中，第一个RERS的核苷酸序列与第二个RERS相同；当本发明的方法需要使用含有NERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中NERS具有核苷酸序列为5’GAGTC3’的有义链；当本发明的方法需要延伸核酸分子时，那么在一个实施方案中该延伸是通过聚合酶链反应进行的；该方法利用双链的目标核酸；该方法利用单链的目标核酸；当方法包括可选择的用限制性内切核酸酶消化延伸产物的步骤时，那么在本发明的一个实施方案中，该方法包括用限制性内切核酸酶消化延伸产物的步骤，而在另一个实施方案中省略了用限制性内切核酸酶消化延伸产物的步骤；有时在表征单链核酸片段以获得有关遗传变异的信息之前，模板核酸可固定于固体支持体上，而在一个实施方案中，不含有切割位点的核酸链附着于固体支持体上，可选择地在该链的3’末端或者可选择地在该链的5’末端附着，而在另一个实施方案中，包括经过在NS进行切割形成的3’末端的核酸片段的5’末端附着于固体支持体上，而在另一个实施方案中，包括经过在NS进行切割形成的5’末端的核酸片段的3’末端附着于固体支持体上；在有些情况下，目标核酸和第一个和第二个ODNP可用于形成模板，该模板经过扩增程序可提供单链核酸片段，且在这些情况下，目标核酸或第一个ODNP或第二个ODNP可固定于固体支持体上，而进行延伸以形成模板的第一个或第二个ODNP的末端优选地不是连接到固体支持体上的ODNP的末端，且目标核酸可非特异性地(即在任一个末端)或者更优选地在目标核酸的3’末端或5’末端进行固定。
如前文提及的，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，而该遗传变异可为单核苷酸多态(SNP)。例如，在一方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定SNP的方法，而该方法包括(a)提供部分或完全双链的模板核酸，该模板核酸包含在限定位置包括SNP的目标核酸的一部分，并进一步包含位于遗传变异的5’即SNP的5’的切割位点(NS)。(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的切割性内切核酸酶(NE)存在时在等温条件下扩增单链核酸片段，该单链核酸片段包含遗传变异即SNP、含有不超过17个核苷酸，且其5’末端位于NS。(c)至少用液相层析和/或质谱分析法表征单链核酸片段以借此鉴定SNP。作为另一个例子，在另一方面，本发明提供了在目标核酸的限定位点鉴定SNP的方法，该方法包括(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且进一步包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列且进一步包含RERS。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个ODNP和第二个ODNP的延伸产物。(c)用识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)消化步骤(b)中的延伸产物以生产消化产物。(d)用步骤(b)的延伸产物或步骤(c)的消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增含有不超过17个核苷酸的单链核酸片段。(e)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(d)的单链片段以借此在目标核酸中鉴定SNP。本发明也提供了在目标核酸的限定位置鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包括(a)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP互补链5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(b)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个RERS两者的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个RERS和第二个RERS的限制性内切核酸酶(RE)存在时，于等温条件下扩增含有不超过17个核苷酸的单链核酸片段。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定SNP。本发明也提供了在目标核酸的限定位置鉴定SNP的方法，该方法包括(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而第一个和第二个ODNP各自进一步包含相同切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含两个NERS的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增含有不超过17个核苷酸的单链核酸片段。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定SNP。在另外一个方面，本发明提供了在单链目标核酸的限定位置鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包括(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，第二个ODNP包含至少基本与目标核酸互补链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述目标核酸互补链的核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互补的核苷酸的3’，第一个和第二个ODNP各自进一步包含中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，完整的IRERS是具有第一链和第二链的双链核酸且包含由可变识别序列(VRS)连接的第一个和第二个CRS，且第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和完整IRERS的片段，其中SNP位于VRS中。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增单链核酸片段，其中单链片段含有不超过17个核苷酸。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定SNP。
作为实行在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异如SNP的方法的方便方式，本发明提供了各种试剂盒。在一方面，当目标核酸是双链即具有第一和第二链时，特别有用的本发明的试剂盒包括(i)包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列且也包括至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个寡核苷酸引物(ODNP)。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。第二个ODNP可选择地也含有限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列。在另一方面，当目标核酸是单链时，特别有用的本发明的试剂盒包括(i)包括与NERS的有义链相同的核苷酸序列且进一步包括至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸中存在的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。第二个ODNP可选择地包括RERS的一条链中存在的核苷酸序列。在另外一个方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，该试剂盒当目标核酸是双链即具有第一链和第二链时特别有用，该试剂盒包括(i)包括至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸的第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个ODNP。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。在该试剂盒中，第一个和第二个ODNP各自进一步包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。在另外一个方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，该试剂盒当目标核酸是单链时特别有用，该试剂盒包括(i)包括至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。在该试剂盒中，第一个和第二个ODNP各自进一步包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。本发明也提供了在具有第一和第二链的目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，包含第一个寡核苷酸引物(ODNP)和第二个寡核苷酸引物(ODNP)，其中(a)第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸的第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(b)第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(c)第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；和(d)由识别NERS的切割性内切核酸酶在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过25个核苷酸。本发明也提供了在单链目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，包含第一个寡核苷酸引物(ODNP)和第二个寡核苷酸引物(ODNP)，其中(a)第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，(b)第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(c)第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列，和(d)由识别NERS的切割性内切核酸酶在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过25个核苷酸。
可选择地，在这些在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异如SNP的试剂盒中，可存在下面的标准和/或成分，而任何两个标准和/或成分可以进行组合以描述试剂盒或其内容在根据本发明的方法用第一个和第二个ODNP作为引物及用目标核酸作为模板进行扩增的双链核酸分子中，由识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)在另一条链上产生的切割位点的位置之间的距离不超过40个、或不超过39个、或不超过38个、或不超过37个、或不超过36个、或不超过35个、或不超过34个、或不超过33个、或不超过32个、或不超过31个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；在用第一个和第二个ODNP作为引物及用目标核酸作为模板进行扩增的双链核酸分子中，由识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过40个、或不超过39个、或不超过38个、或不超过37个、或不超过36个、或不超过35个、或不超过34个、或不超过33个、或不超过32个、或不超过31个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；NERS具有序列5’GAGTC3’；N.BstNB I；N.BstNB I的缓冲液；识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)；RE的缓冲液；DNA聚合酶；选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶；DNA聚合酶的缓冲液；NE和DNA聚合酶两者的缓冲液；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；反相液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A，该铵盐的胺成分可选择地选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，该仲或叔胺可选择地与有机酸复合，该有机酸可选择地选自乙酸、丙酸及其卤化形式；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B，该有机溶剂可选择地选自甲醇和乙腈；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；对照模板核酸分子和对照ODNP对；海藻糖；寡核苷酸标准；和/或用于设计或定购ODNP对的软件存取码。例如，试剂盒可进一步包括识别RERS的RE和RE的缓冲液、识别NERS的NE和NE的缓冲液以及DNA聚合酶和DNA聚合酶的缓冲液。
除提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法之外，本发明还提供了在(多个)目标核酸的限定位置多重鉴定(多个)遗传变异的方法。因而，单个样品可含有两个或多个核酸，每一个核酸均具有遗传变异。通过适当选择引物，可分析具有特定遗传变异的核酸的存在与否，或特定遗传变异是否存在于特定核酸样品中，该样品含有多个潜在的遗传变异。例如，在一方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法，该方法包括(a)对于所研究的目标核酸中的每一个遗传变异，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中a)如果研究中的目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的可选择的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而b)如果研究中的目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含RERS的一条链的可选择的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)可选择地，即该步骤可根据本发明的方法进行或不进行，用识别RERS的RE切割延伸产物以提供消化产物。(c)用步骤(a)(ii)的每一个延伸产物或步骤(c)的每一个消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(d)表征扩增的单链片段以借此鉴定遗传变异。在相关方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定单核苷酸多态的方法，该方法包括(a)对于每一个目标核酸，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者如果b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含RERS的一条链的序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)用识别RERS的RE切割延伸产物以提供消化产物。(c)用步骤(a)(ii)的每一个延伸产物或步骤(c)的每一个消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶存在时扩增单链核酸片段，优选在等温条件下。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法来表征单链片段以借此鉴定遗传变异。
在相关方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法，该方法包括(a)对于每一个目标核酸，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中a)如果且当目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸时，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果且当b)目标核酸是单链核酸时，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，在每一种情况下，第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列，(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)用每一个延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(c)表征步骤(b)的单链片段以借此鉴定遗传变异。在相关方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包括(a)对于每一个目标核酸，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，在每一种情况下，第一个和第二个ODNP各自进一步包含同一切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；且(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)用每一个延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段各自优选地含有不超过17个核苷酸。(c)至少部分用液相层析和/或质谱分析法来表征步骤(b)的单链片段以借此鉴定遗传变异。
在(多个)目标核酸的限定位置多重鉴定(多个)遗传变异的方法中，一种或多种额外的标准可用于描述该方法，而这些额外的标准在此处公开并包括那些在上文中连同用于在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异如SNP的本发明的方法一起阐明的标准，这些标准的任何一个或多个可用于描述本发明的方法。例如，一些可用于描述在(多个)目标核酸的限定位置多重鉴定(多个)遗传变异的方法的标准包括至少一个遗传变异是SNP；至少一个遗传变异与疾病如人类遗传疾病相关；至少一个遗传变异与病原微生物的药物抗性相关；至少一个目标核酸是基因组核酸；至少一个目标核酸是cDNA；至少一个目标核酸源自病原病毒的基因组；至少一个目标核酸源自病原细菌的基因组；至少一个目标核酸源自病原细菌的附加体；如果目标核酸是双链时至少基本与目标核酸第一链互补的或如果目标核酸是单链时与目标核酸相同的第一个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个核苷酸；如果目标核酸是双链时至少基本与目标核酸第二链互补的或如果目标核酸是双链时与目标核酸互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个核苷酸；RERS可由II型限制性内切核酸酶识别；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶识别；RERS可由Bpm I识别；RERS可由间断的限制性内切核酸酶识别；NERS是5’GAGTC3’；延伸是用聚合酶链反应进行的；扩增是在DNA聚合酶如exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶存在时进行的；扩增是在等温条件下进行的；步骤(c)的单链核酸片段含有不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个核苷酸；表征包括一种或多种选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振、电子电离、凝胶电泳和毛细管电泳的技术；表征是由包括质谱分析法的一种或多种方法进行的；该方法进一步包括在进行步骤(c)之前组合步骤(a)(ii)中至少两个延伸反应的产物的步骤；在进行步骤(c)之前组合步骤(a)(ii)中每一个延伸反应的产物的步骤；该方法包括用识别RERS的RE切割延伸产物以提供消化产物的步骤；该方法省略了用识别RERS的RE切割延伸产物的步骤，从而未形成消化产物。
在另一套相关的实施方案中，本发明提供了可用于在目标核酸的位置多重鉴定遗传变异的方法的试剂盒。在这些实施方案之一中，对于每一个研究中的目标核酸，该试剂盒包括(a)如果目标核酸是具有第一和第二链的双链核酸，那么试剂盒具有(i)包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列及至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个寡核苷酸引物(ODNP)，和(ii)可选择地包括限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列的且具有至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP；且如果(b)一个或多个目标核酸是单链的，那么对于每一个单链目标核酸，该试剂盒包括(i)包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP，和(ii)第二个ODNP，该ODNP可选择地包含与RERS的一条链相同的核苷酸序列，并且必须含有至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在相关方面，本发明提供了用于在目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法的试剂盒，对于每一个研究中的目标核酸，该试剂盒包括(a)如果特别的目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么对于每一个类型的目标核酸，该试剂盒具有(i)包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个寡核苷酸引物(ODNP)，和(ii)包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP；然而对于(b)每一个研究中的目标核酸是单链核酸，该试剂盒包括(i)包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP，和(ii)包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP，其中第一个和第二个ODNP进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。
在目标核酸的位置多重鉴定遗传变异的方法中特别有用的本发明的试剂盒中，一种或多种下面的标准可用于描述该试剂盒，而这些标准可进行任何组合，且该试剂盒设计为用于如在此处所描述的多重鉴定遗传变异的方法中，且这些标准是非限制性的，即其他标准可在文中其它地方出现存在于核酸分子中的NERS具有序列5’GAGTC3’；N.BstNB I存在于试剂盒中；该试剂盒含有N.BstNB I的缓冲液；该试剂盒含有识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)；该试剂盒含有RE的缓冲液；该试剂盒含有DNA聚合酶；该试剂盒含有一种或多种exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；该试剂盒含有DNA聚合酶的缓冲液；该试剂盒含有适合于切割性内切核酸酶和DNA聚合酶的缓冲液；该试剂盒含有适合于NE的缓冲液和适合于DNA聚合酶的不同缓冲液；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；反相液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A，该铵盐的胺成分可选择地选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，该仲或叔胺可选择地与有机酸复合，该有机酸可选择地选自乙酸、丙酸及其卤化形式；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B，该有机溶剂可选择地选自甲醇和乙腈；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；对照模板核酸分子和对照ODNP对；海藻糖；寡核苷酸标准；和/或用于设计或定购ODNP对的软件存取码。例如，试剂盒可进一步包括识别RERS的RE和RE的缓冲液、识别NERS的NE和NE的缓冲液以及DNA聚合酶和DNA聚合酶的缓冲液。
在另一方面，本发明提供了确定样品中目标核酸存在与否的方法。这些方法在诊断中是特别有用的，在该诊断中，想要的是确定特定样品如来自病人的样品是否含有特定目标核酸，如在致病生物体中通常发现的核酸。在一个实施方案中，该方法包括(a)使存在于样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合。使核酸分子与探针在允许探针与可能存在于样品中的目标核酸进行杂交的条件下混合。该探针特征在于具有(i)可由切割剂(NA)识别的切割剂识别序列(NARS)，该切割剂在切割位点(NS)进行切割，和(ii)含有NS或进行延伸能含有NS的一条链中的5’突出端，或者不含有NS或不能进行延伸以含有NS的一条链中的3’突出端，其中在每一种情况下，突出端包括至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NA和DNA聚合酶存在时进行扩增反应以提供扩增产物，该扩增反应优选地是在与目标核酸杂交的探针上进行的。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定样品中目标核酸的存在与否。在相关的涉及确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法的方面，该方法包括(a)使样品的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合以使得探针与目标核酸进行杂交，该探针包含(i)可由切割性内切核酸酶(NE)识别的切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，当识别了NERS之后，NE在双链核酸的称作切割位点(NS)的位置上产生了切口，和(ii)含有NS的探针链中的或进行延伸并在延伸后含有NS的探针链中的5’突出端，或者不含有NS的或不能进行延伸以含有NS的链中的3’突出端，其中突出端(不论5’还是3’)包含至少基本与目标核酸互补的核苷酸序列。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NA和DNA聚合酶存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应以提供扩增产物，该扩增产物优选地含有不超过17个核苷酸。(d)优选地至少部分用液相层析和/或质谱分析法探测步骤(c)的扩增产物的存在与否，该探测步骤使得能够确定目标核酸是否存在于样品中。在相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)来自目标样品的核酸分子，这些核酸分子可包括或不包括目标核酸；(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含(a)至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的第一个核苷酸序列，(b)切割剂识别序列(NARS)反义链的核苷酸序列，和(c)第二个序列；(iii)识别NARS的切割性内切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持步骤(A)中的混合物，在该条件下如果目标核酸存在于样品中则可用单链核酸探针作为模板扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关的实施方案中，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)来自样品的核酸分子；(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含(a)至少基本与存在于所研究的目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(b)切割剂识别序列(NARS)有义链的核苷酸序列，和(iii)识别第一个NARS的切割性内切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持混合物，该条件使得如果目标核酸存在于样品中则能够扩增至少基本与目标核酸互补的单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该目标核酸包括切割剂识别序列(NARS)。该方法包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)样品的核酸分子，和(ii)识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持(A)中的混合物，该条件使得如果目标核酸存在于样品中则可用目标核酸的部分作为模板扩增单链核酸片段。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关方面，本发明提供了确定目标核酸是否存在的方法，该目标核酸具有包括第一个切割剂识别序列(NARS)的核苷酸序列的核苷酸序列。该方法包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)样品的核酸分子，(ii)基本与目标核酸的一条链相同且包含与NARS的反义链核苷酸序列相同的核苷酸序列的单链核酸探针，和(iii)识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持混合物，该条件使得在目标核酸存在于样品中的情况下可用探针的部分作为模板扩增单链核酸片段。(C)探测步骤(B)中单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关的方法中，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法。该方法包括(A)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和样品核酸分子的混合物，其中(i)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一链的第一部分互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二链的第二部分互补的核苷酸序列且包含第二个RERS的有义链的序列，其中该第二部分位于目标核酸第二链中第一部分互补链的3’，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个RERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一部分相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二部分互补的核苷酸序列且包含第二个RERS的有义链的序列，其中该第二部分位于目标核酸中第一部分的5’。(B)将(A)的混合物置于一定条件下，如果目标核酸存在于样品中，该条件将(i)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个RERS两者的延伸产物；和(ii)用步骤(B)(i)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个和第二个RERS的一种或多种限制性内切核酸酶(RE)存在时扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。可选择地，第一个RERS与第二个RERS相同。在相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法。该方法包括(A)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和样品核酸分子的混合物，其中(i)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含存在于第一个切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链中的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一链的第一部分互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二链的第二部分互补的核苷酸序列且进一步包含第二个NERS的有义链的核苷酸序列，其中该第二部分位于目标核酸第二链中第一部分互补链的3’，或者，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个NERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一部分相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二部分互补的核苷酸序列且进一步包含第二个NERS的有义链的序列，其中该第二部分位于目标核酸中第一部分的5’。(B)将混合物置于一定条件下，如果目标核酸存在于样品中，则(i)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个NERS两者的延伸产物；和(ii)用步骤(B)(i)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个和第二个NERS的一种或多种切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度为最多25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在一个实施方案中，第一个NERS与第二个NERS相同。在另一个相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)来自样品的核酸分子，和(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含至少基本与位于或靠近目标核酸5’末端的目标核酸部分互补的核苷酸序列和切割剂识别序列(NARS)反义链的序列。(B)将与目标杂交的探针分子如果存在与那些未与目标杂交的进行分离。(C)在与目标杂交的探针分子(如果存在)和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应。(D)探测步骤(C)中用单链核酸探针作为模板扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在本发明涉及确定样品中是否存在目标核酸的方法的另一个相关方面，本发明提供了方法，包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)样品的核酸分子，(ii)经由其5’末端固定于固体支持体上的单链核酸探针，该探针从3’到5’的方向包含(a)至少基本与位于或靠近目标的3’末端的目标部分互补的核苷酸序列，和(b)切割剂识别序列有义链的序列。(B)去除样品中未与探针进行杂交的核酸分子，使其不与固体支持体接触。(C)在固定于步骤(B)的固体支持体上的探针和识别切割剂识别序列的切割剂存在时进行扩增反应。(D)探测步骤(C)中用目标核酸的部分作为模板扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。
在本发明涉及确定样品中目标核酸存在与否的各个实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述实施方案，而任何2个、3个、4个等标准可进行组合以描述实施方案，且这些实施方案是附加于其他在别处描述的实施方案的步骤(d)至少部分由选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的技术进行，而表征可由这些技术的1种、2种、3种或更多来进行，和/或表征可用其他适当的和/或易于采用的表征技术加上这些技术的1种、2种、3种或更多来进行；样品中的目标核酸均为单链的；样品中的目标核酸均为双链的；样品中的目标核酸是单链和双链目标核酸的混合物；含有目标核酸或目标核酸所源自的生物学样品源自哺乳动物，如人类、母牛、马、狗、绵羊、鹿、猪，或可描述为来自患者的；目标核酸是源自宿主的核酸分子，该宿主选自细菌、和/或病毒、和/或真菌、和/或寄生物；NA是N.BstNB I；扩增是在DNA聚合酶存在时进行的，下面是示例性的适当的DNA聚合酶，且下面的DNA聚合酶中的任何两个或更多可进行组合以形成本发明所用的DNA聚合酶所选自的组合exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，例如，聚合酶可选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；扩增是在等温条件下进行的；扩增是在标记的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；扩增是在标记的脱氧核苷三磷酸存在时进行的，该标记的脱氧核苷三磷酸是与标记连接的脱氧核苷三磷酸，该标记可为放射性标记和/或酶和/或荧光染料和/或洋地黄毒苷和/或生物素，这些是示例性的标记；探测扩增产物是否已形成，且如果已形成了，则进一步探测扩增产物的一些或全部核苷酸序列，这是至少部分由一种或多种包括发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的技术实现的，例如，分析可用发光光谱法、荧光光谱法或质谱分析法实现；如果存在，扩增产物含有不超过3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个、或21个、或22个、或23个、或24个、或25个、或26个、或27个、或28个、或29个、或30个、或31个、或32个、或33个、或34个、或35个、或36个、或37个、或38个、或39个、或40个、或41个、或42个、或43个、或44个、或45个、或46个、或47个、或48个、或49个、或不超过50个核苷酸；存在于样品中的核酸分子固定于固体支持体上；扩增产物在探测之前固定于固体基质上；单链核酸探针固定于固体支持体上。
作为进行确定特定目标核酸是否存在于样品中的方法的方式，本发明提供了各种试剂盒。在各个实施方案中，试剂盒包括一种或多种下面的成分，而这些成分的任何两个或多个可进行组合以描述根据本发明的试剂盒如在前文描述的涉及确定样品中目标核酸是否存在的方法中的部分双链寡核苷酸探针；两个单链寡核苷酸，当它们相互退火时，产生如在前文涉及确定样品中目标核酸是否存在的方法中描述的双链寡核苷酸探针；其中NARS由N.BstNB I识别的试剂盒；包括N.BstNB I的试剂盒；N.BstNB I的缓冲液；识别NARS的NA；DNA聚合酶；DNA聚合酶的缓冲液；适合于NE和DNA聚合酶两者的缓冲液；适合于NE的缓冲液和适合于DNA聚合酶的不同缓冲液；exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶中的至少一种；标记的脱氧核苷三磷酸，该标记的脱氧核苷三磷酸可为如与放射性标记连接的、与酶连接的、与荧光染料连接的、与洋地黄毒苷连接的或与生物素连接的脱氧核苷三磷酸；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；反相液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A，该铵盐的胺成分可选择地选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，该仲或叔胺可选择地与有机酸复合，该有机酸可选择地选自乙酸、丙酸及其卤化形式；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B，该有机溶剂可选择地选自甲醇和乙腈；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；对照模板核酸分子和对照ODNP对；海藻糖；寡核苷酸标准；用于设计或定购探针的软件存取码；用可结合核酸分子的化学层包被的针，例如用聚乙烯亚胺层包被的针，或用PDADMAC即聚二烯丙基二甲基氯化铵(polydiallyldimethylammonium chloride)包被的针；和/或海藻糖。
本发明也提供了多重确定生物学样品中多个目标核酸存在与否的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)使来自生物学样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合以使得探针与可能存在于样品中的任何目标核酸进行杂交，其中每一个探针包含(1)可由NA识别的切割剂识别序列(NARS)，当识别了NARS之后，NA将在位于称作切割位点(NS)的位置切割核酸的双链部分，(2)含有NS或能延伸以含有NS的链中的5’突出端，或者不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的3’突出端，该突出端(不论是5’还是3’)包含至少基本与存在于目标核酸互补的核苷酸序列，和(3)位于不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的序列，该序列位于相应于NS的位置的5’，且该序列唯一地与目标核酸(其中突出端与该目标核酸至少基本互补)相关。(3)的序列有效地提供了对于特定目标核酸唯一的信号，从而对该信号的探测表示由(3)的序列“编码”的特定目标核酸的存在。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NA和DNA聚合酶存在时进行扩增反应。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定生物学样品中与扩增产物序列相关的目标核酸的存在与否。在另一个相关方面，本发明提供了多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法，该方法包括(a)使生物学样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针在使得探针能够与目标核酸进行杂交的条件下混合，其中每一个探针包含(1)可由切割性内切核酸酶(NE)识别的切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，该NE可在靠近NERS的称作切割位点(NS)的位点切割双链核酸分子，(2)不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的5’突出端，或者不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的3’突出端，该突出端(不论是5’还是3’突出端)包含至少基本与目标核酸互补的核苷酸序列，和(3)位于不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的序列，该序列位于相应于NS的位置的5’，且该序列唯一地与目标核酸(其中突出端与该目标核酸至少基本互补)相关。(3)的序列有效地提供了对于特定目标核酸唯一的信号，从而对该信号的探测表示由(3)的序列“编码”的特定目标核酸的存在。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NE和DNA聚合酶存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应以提供扩增产物。在各个实施方案中，扩增产物各自含有不超过17、16、15、14、13或12个核苷酸。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以确定生物学样品中与扩增产物的序列相关的目标核酸的存在。可选择地，探测步骤需要至少部分使用液相层析和/或质谱分析法。
在进一步描述本发明涉及多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法中，可利用一个或多个额外的标准。部分地，在上文中连同本发明涉及确定样品中目标核酸存在与否的方法一起阐明的标准也可以任何组合用于进一步表征本发明涉及多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法。例如，样品可来自患者。其他适合于进一步表征多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的标准可出现于文中别处。同样地，该方法可用固定于固体支持体上的核酸分子来进行。例如，可将探针以任何阵列形式固定于固体支持体上的唯一位置。可选择地，可将探针无区别地固定于固体支持体上。在每一种情况下，含有目标核酸的样品将与固定的探针接触。可选择地，可将目标核酸固定于固体支持体上，然后将探针添加到支持体上以使其与固定的目标接触。
本发明也提供了可用于如在此处所描述的多重确定生物学样品中几个目标核酸存在与否的方法中的试剂盒。这些试剂盒可包括前文中对用于非多重方法中的试剂盒描述的成分中的一些或全部，该非多重方法为确定一个生物学样品中一个目标核酸存在与否的方法。对于多重方法特别有用的该试剂盒可简单地包括更多探针，或更多可用于制备探针的单链寡核苷酸，从而检验多个目标的存在。同样地，当试剂盒含有多个探针(或探针成分)时，设计该多个探针或其成分以对不同目标提供独特信号。在一方面，该试剂盒含有2个不同的探针(或探针成分)，而在另一方面，试剂盒含有3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个、或22个、或24个、或26个、或28个、或30个、或35个、或40个、或45个、或50个、或55个、或60个、或65个、或70个、或75个、或80个、或85个、或90个、或95个、或100个不同的探针或探针成分。该试剂盒可包括固定的探针，如在固体表面固定于唯一位置的探针，或在固体表面无区别地固定的探针。
当核酸根据本发明的方法或组合物或试剂盒固定于固体支持体上时，适当的固体支持体包括完全或部分由硅、玻璃、纸、陶瓷、金属、准金属(metalloid)和塑料形成的材料。在一个实施方案中，固体支持体是用结合核酸分子的化学层包被的。一种适当的化学层由聚乙烯亚胺形成。另一种适当的化学层由PDADMAC即聚二烯丙基二甲基氯化铵形成。
在另一方面，本发明提供了确定核酸分子群体中第一个核酸分子的数目与第二个核酸分子的数目之间的比率的方法，其中第一个和第二个核酸分子的核苷酸序列除限定的位置之外是相同的。该方法包括(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中如果(i)第一个和第二个核酸是双链的，均具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸分子第一链的核酸序列互补的核苷酸序列，该序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸第二链的核酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列也位于限定位置的3’，然而，如果(ii)第一个和第二个核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸分子中的核酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸中的核酸序列互补的核苷酸序列，该序列位于限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段。(d)确定源自第一个核酸的步骤(c)的单链核酸片段的数目相对于源自第二个核酸的单链核酸片段数目的比率。本发明也提供了确定核酸分子群体中第一个核酸分子的数目与第二个核酸分子的数目之间的比率的方法，其中第一个和第二个核酸分子的核苷酸序列除限定的位置之外是相同的。该方法包括(a)混合第一个ODNP、第二个ODNP和核酸群体，其中如果(i)第一个和第二个核酸是双链的(即每一个均具有第一链和第二链)，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与第一个核酸分子第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与第一个核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)第一个和第二个核酸各自是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸分子中的核酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列在第一个核酸中位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于第一个核酸中限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。在各个实施方案中，单链核酸片段各自含有不超过20个、或18个、或18个、或17个、或16个、或15个、或14个、或13个、或12个、或11个、或10个等核苷酸。(d)确定源自第一个核酸分子的步骤(c)的单链核酸片段的数目相对于源自第二个核酸分子的数目的比率。该确定可用如液相层析和质谱分析法的一种或两种来进行。在相关方法中，本发明提供了对在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的确定，该目标核酸分子存在于核酸群体中。该方法包括(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中如果(i)目标核酸是双链的，从而具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，然而，如果(ii)目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，且不论目标核酸是单链的还是双链的，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段。(d)确定具有遗传变异的目标核酸分子相对于存在于样品中的所有目标核酸分子的等位基因频率。该确定为通过确定步骤(c)中形成的含有可选择地存在于目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A相同(除研究的遗传变异之外)的所有单链核酸片段的百分比以借此确定目标核酸的等位基因频率。在相关的实施方案中，本发明提供了确定在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，该目标核酸包含于核酸群体中。该方法包括(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸分子群体(其中一些为目标核酸)，其中如果(i)目标核酸是双链的，从而具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段各自含有不超过20个、或19个、或18个、或17个、或16个、或15个、或14个、或13个、或12个、或11个、或10个等核苷酸。(d)确定目标核酸中遗传变异的等位基因频率。该确定为通过如确定步骤(c)中形成的含有可选择地存在于目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A相同(除遗传变异之外)的所有单链核酸片段的百分比。这种确定可用液相层析和质谱分析法之一或二者来进行，这些技术仅仅是示例性的。
在相关的实施方案中，本发明方法涉及(i)确定存在于核酸分子群体中的第一个核酸分子的数目与存在于核酸分子群体中的第二个核酸分子的数目之间的比率，和(ii)确定核酸分子群体中具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率。这些方法可各自同时在超过一个目标核酸分子上进行，即该方法可通过多重确定而进行。例如，在一方面，本发明提供了多重确定各自在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，其中这些目标核酸分子存在于核酸群体中，该方法包括(a)混合核酸群体和ODNP对，每一个ODNP对相应于目标核酸之一并包含第一个ODNP和第二个ODNP，其中如果(i)研究中的目标核酸是双链的，从而具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，或者，如果(ii)研究中的目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。(b)延伸每一个ODNP对的第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时，用步骤(b)的延伸产物作为模板扩增单链核酸片段。(d)对于每一个目标核酸，确定步骤(c)的含有目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A在遗传变异之外的部分相同的所有单链核酸片段的百分比以借此确定目标核酸的等位基因频率。
在相关方面，本发明提供了多重确定在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，这些目标核酸分子包含于核酸群体中，且该方法包括(a)混合核酸群体和ODNP对，每一个ODNP对相应于目标核酸之一并包含第一个ODNP和第二个ODNP，其中如果(i)研究中的目标核酸是双链的(从而具有第一链和第二链)，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)研究中的目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。(b)延伸每一个ODNP对的第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，用步骤(b)的延伸产物作为模板，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。可选择地，单链核酸片段各自含有不超过20个、或19个、或18个、或17个、或16个、或15个、或14个、或13个、或12个、或11个、或10个等核苷酸。(d)对于每一个目标核酸，确定步骤(c)中的含有可选择地存在于目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A在遗传变异之外的部分相同的所有单链核酸片段的百分比，以借此确定目标核酸的等位基因频率。
在本发明这些涉及(i)确定存在于核酸分子群体中的第一个核酸分子的数目与存在于核酸分子群体中的第二个核酸分子的数目之间的比率，和(ii)确定核酸分子群体中具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法中，可利用一种或多种下面的标准来描述该方法，下面标准中的任何2个、3个、4个、5个等可进行组合以描述该方法，且下面标准中的任何1个、2个、3个、4个等可与在此处阐明的其他标准进行组合以描述本发明的方法由扩增步骤形成的且含有进行等位基因频率测量或确定上述比率所需的信息的单链核酸片段具有至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个；由扩增步骤形成的单链核酸片段具有不超过3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个、或21个、或22个、或23个、或24个、或25个、或26个、或27个、或28个、或29个、或30个、或31个、或32个、或33个、或34个、或35个、或36个、或37个、或38个、或39个、或40个、或41个、或42个、或43个、或44个、或45个、或46个、或47个、或48个、或49个、或50个核苷酸；该方法中所用的NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)；延伸反应是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；该方法中所用的NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是可由N.BstNB I识别的NERS；第一个ODNP包含RERS一条链的核苷酸序列，但不包含NERS的有义链的核苷酸序列；第二个ODNP包含RERS一条链的核苷酸序列，但不包含NERS的有义链的核苷酸序列；由延伸步骤产生的片段不含有半修饰的RERS；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶识别；在进行步骤(c)之前步骤(b)的片段是由识别RERS的RE消化的；限定位置的核苷酸是与疾病相关的；核酸群体来自哺乳动物如人类、狗、猫、猪、马或兔，DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶中的任何一种，所用的DNA聚合酶的任何两种或多种可进行组合以形成所阐明的用于本发明的可能的DNA聚合酶组合，如DNA聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；延伸反应由聚合酶链反应进行；扩增是在等温条件下进行的；扩增是在50℃-70℃的温度范围内进行的；扩增是在60℃进行的；扩增是在55±5℃进行的；扩增是在60±5℃进行的；扩增是在65±5℃进行的；扩增是在70±5℃进行的；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高20℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高15℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高10℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高5℃之内；在本发明的各个实施方案中，该方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；该方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地且可选择地不超过50个、或不超过45个、或不超过40个、或不超过35个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个核苷酸；当方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地为至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；当本发明的方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；为获得想要的信息而对扩增产物上进行的测量包括下面分析方法中的1种、或任何2种、或任何3种或更多，而额外的分析方法也依赖于特定情况而采用，如仪器的可用性发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳，如测量可至少部分由质谱分析法进行，或测量可至少部分由液相层析进行，且测量可由包括质谱分析法和液相层析两者的分析技术来进行。
在另一方面，本发明提供了探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的方法，该方法包括(a)混合第一个ODNP、第二个ODNP和cDNA。第一个ODNP包括至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的核苷酸序列。第二个ODNP包括至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的核苷酸序列。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包括切割剂识别序列(NARS)的有义链的核苷酸序列。(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中时可产生由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段的条件下进行延伸反应。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应。(d)表征步骤(c)的扩增产物以借此确定ExonA和Exon B之间连接的存在与否。在相关方面，本发明提供了探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的方法，该方法包括(a)混合第一个ODNP、第二个ODNP和cDNA。第一个ODNP包括至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的核苷酸序列。第二个ODNP具有包括至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的序列的核苷酸序列。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中时可产生由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段的条件下进行延伸反应。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应。(d)表征步骤(c)的扩增产物以借此确定Exon A和Exon B之间连接的存在与否。该表征可至少部分用液相层析和/或质谱分析法进行。在这些方法可选择的实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述该方法NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)且延伸反应是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是RERS且延伸是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是NERS；NARS可由N.BstNB I识别；第一个ODNP不含有NERS有义链的核苷酸序列，但包括RERS的一条链的核苷酸序列；第二个ODNP不含有NERS有义链的核苷酸序列，但包括RERS的一条链的核苷酸序列；由延伸反应产生的片段不含有半修饰的RERS；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶(RE)识别；在进行步骤(c)之前步骤(b)的延伸产物是由识别RERS的RE消化的；基因与疾病相关；基因与人类疾病相关；DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的K1enow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，这些DNA聚合酶的任何两种或多种可组合在一起以形成本发明方法中所用的DNA聚合酶所选自的组合，如DNA聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；延伸反应由聚合酶链反应进行；扩增是在等温条件下进行的；扩增产物如果存在则是含有不超过35个、或不超过17个、或不超过12个核苷酸的单链核酸片段；表征是至少部分由选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的分析技术来实现的，如表征可至少部分由质谱分析法进行。
在另一方面，本发明提供了在cDNA分子或cDNA群体中探测包含n个外显子的基因的每两个外显子之间的连接存在与否的方法，其中n是等于或大于2的整数，Exon A是存在于基因中的外显子中最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子，该方法包括(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群体。第一套ODNP包括n-1个ODNP，该套中的每一个成员相应于基因中除ExonA之外的n个外显子之一，且此外每一个ODNP包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子有义链的部分互补的核苷酸序列。第二套ODNP包括相应于除Exon N之外的每一个外显子的n-1个ODNP，而每一个ODNP包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子反义链的部分互补的核苷酸序列。在本发明的第一个实施方案中是第一套ODNP成员的、或在本发明的第二个实施方案中是第二套ODNP成员的、或在本发明的第三个实施方案中是第一套或第二套ODNP成员的每一个ODNP进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的核苷酸序列。(b)扩增包含来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应。(d)探测来自步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定每一个潜在连接的存在与否。
在相关方面，本发明提供了在cDNA分子或cDNA群体中探测包含n个外显子的基因的每两个外显子之间的连接存在与否的方法，其中n是等于或大于2的整数，Exon A是存在于基因中的外显子中最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子，该方法包括(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群体。第一套ODNP包括n-1个ODNP，该套中的每一个成员相应于除Exon A之外的唯一一个外显子，且每一个ODNP也包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子有义链的部分互补的核苷酸序列。第二套ODNP包括n-1个ODNP，该套中的每一个成员相应于除Exon N之外的唯一一个外显子，且每一个ODNP进一步包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子反义链的部分互补的核苷酸序列。此外，在本发明的第一个实施方案中是第一套ODNP成员的、或在本发明的第二个实施方案中是第二套ODNP成员的、或在本发明的第三个实施方案中是第一套或第二套ODNP成员的每一个ODNP进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)扩增由来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP包围的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否。在一个实施方案中，该探测是由液相层析和/或质谱分析法进行的。该探测使得随后能够确定研究中的每一个潜在连接的存在与否。在一个实施方案中，步骤(c)的扩增产物如果存在则含有不超过17个核苷酸。在本发明的各个实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述该实施方案NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)且步骤(b)是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一套ODNP和第二套ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是RERS且步骤(b)是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是NERS；NERS可由N.BstNB I识别；第一套中的ODNP或第二套中的ODNP含有RERS一条链的核苷酸序列，但不包含NERS的有义链的序列；由步骤(b)产生的片段不含有半修饰的RERS；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶(RE)识别；在进行步骤(c)之前步骤(b)的扩增片段是由识别RERS的RE消化的；基因与疾病相关；基因与人类疾病相关；步骤(b)是由聚合酶链反应进行的；步骤(c)是在等温条件下进行的；步骤(c)中的扩增产物如果存在则是含有不超过35个核苷酸的单链核酸片段；该单链核酸片段含有不超过17个核苷酸；该单链核酸片段含有不超过12个核苷酸；步骤(d)是至少部分由选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的分析技术来实现的；步骤(d)至少部分由质谱分析法进行。
在其他方面，本发明提供了探测cDNA群体中基因的可变剪接的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)根据在此处描述的本发明的方法确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)对于基因的至少一个外显子来说，如果在该外显子的至少一个末端存在超过一个的连接，则显示cDNA群体中存在基因可变剪接。在相关的实施方案中，该方法提供了对cDNA群体中基因可变剪接的多重探测，对于每一个基因，该方法包括(a)根据在此处描述的本发明的方法确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)对于基因的至少一个外显子来说，如果在该外显子的至少一个末端存在超过一个的连接，则显示cDNA群体中存在基因的可变剪接。在相关的实施方案中，本发明提供了探测两个生物学样品之间基因的可变剪接的方法，该方法包括(a)通过进行根据本发明的方法对每一个生物学样品确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)如果在一个生物学样品中存在至少一个连接，而在另一个生物学样品中不存在，则显示两个生物学样品之间存在基因的可变剪接。在相关的实施方案中，本发明提供了多重探测两个生物学样品之间基因的可变剪接的方法，对于每一个基因，该方法包括(a)根据在此处描述的本发明的方法对每一个生物学样品确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)如果在一个生物学样品中存在至少一个连接，而在另一个生物学样品中不存在，则显示两个生物学样品之间存在基因的可变剪接。在相关的实施方案中，本发明提供了用于探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间是否存在连接的寡核苷酸引物(ODNP)对，其中(a)第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的核苷酸序列。第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的核苷酸序列。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)有义链的核苷酸序列。在本发明的该ODNP对的各个实施方案中，下面的标准可用于描述该ODNP对，而下面的标准的任何两个或多个可以可选择地与在文中别处描述的其他标准进行组合NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)；NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是RERS；NARS是NERS；NERS可由N.BstNB I识别；第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列，且第二个ODNP包含RERS一条链(在一个实施方案中为有义链，而在另一个实施方案中为反义链)的核苷酸序列；第一个ODNP包含RERS一条链的核苷酸序列，且第二个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶(RE)识别；基因与疾病相关；第一个ODNP长度至少为12个核苷酸；第二个ODNP长度至少为12个核苷酸。
在另一方面，本发明提供了制备用于合成单链cDNA分子的模板核酸分子的方法，该方法包括(a)提供双链cDNA分子。(b)使双链cDNA分子与包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物连接，从而在识别NARS的切割剂(NA)和DNA聚合酶存在时，用连接产物作为模板扩增的单链核酸分子包含双链cDNA分子一条链的至少一部分。另一方面，本发明提供了制备cDNA文库的方法，该方法包括(a)提供从生物学样品中分离的mRNA分子。(b)用分离的mRNA分子作为模板制备双链cDNA分子。(c)使双链cDNA分子与包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物连接，从而在(i)识别NARS的切割剂和(ii)DNA聚合酶存在时，用连接产物作为模板扩增的单链核酸分子包含双链cDNA分子一条链的至少一部分。在可选择的实施方案中，本发明的这些方法可进一步由下面标准的一种或多种进行表征，这些标准的任何两个或多个可进行组合以表征本发明的方法，且这些标准是非排它性的所述部分长度为至少40个、或至少38个、或至少36个、或至少34个、或至少32个、或至少30个、或至少28个、或至少26个、或至少24个、或至少22个、或至少20个、或至少19个、或至少18个、或至少17个、或至少16个、或至少15个、或至少14个、或至少13个、或至少12个、或至少11个、或至少10个、或至少9个、或至少8个、或至少7个、或至少6个、或至少5个、或至少4个核苷酸；所述部分长度不超过100个、或不超过90个、或不超过80个、或不超过70个、或不超过60个、或不超过50个、或不超过40个、或不超过38个、或不超过36个、或不超过34个、或不超过32个、或不超过30个、或不超过28个、或不超过26个、或不超过24个、或不超过22个、或不超过20个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；双链cDNA分子是经由不参与双链cDNA分子和核酸连接物的连接的末端固定的；核酸连接物是经由不参与双链cDNA分子和核酸连接物的连接的末端固定的；NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶识别序列；当包括连接物时，那么双链cDNA分子或核酸连接物是通过固定材料的末端固定的，其中该末端不参与双链cDNA分子和核酸连接物之间的连接。
在另一方面，本发明提供了一种方法，包括(a)提供一种双链核酸分子，该双链核酸分子包括(i)作为可选择地存在的序列的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(ii)切割剂识别序列(NARS)和(iii)目标核酸的片段。在该双链核酸中，特别是在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)作为可选择的步骤，用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸。(c)在识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段。在相关方面，本发明提供了一种方法，包括(a)提供一种双链核酸分子，该双链核酸分子包括(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(ii)切割性内切核酸酶识别序列(NERS)和(iii)目标核酸的片段。在该双链核酸分子中，特别是在不含有识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NERS的5’，和(2)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸。(c)在识别NARS的NA存在时可选择地于等温条件下扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段含有不超过17个核苷酸。另一方面，本发明提供了制备多个单链核酸探针的方法，该方法包括(a)提供双链核酸分子，每一个双链核酸分子包括(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，而这是双链核酸分子中的可选择的成分；(ii)切割剂识别序列(NARS)，和(iii)目标核酸的片段。此外，在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)该方法包括用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸的可选择的步骤。(c)在识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段。在相关方面，本发明提供了制备多个单链核酸探针的方法，该方法包括(a)提供多个双链核酸分子，每一个双链核酸分子包括(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(ii)切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，和(iii)目标核酸的片段。在这些双链核酸分子中，特别是在不含有识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NERS的5’，和(2)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸。(c)在识别NERS的NE存在时，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。可选择地，该单链核酸片段各自含有不超过25个或不超过17个核苷酸。本发明的这些方法可进一步由下面标准的一种或多种进行描述，下面标准的任何两种或多种可进行组合以描述本发明的这些方法NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶识别序列；NARS可由选自Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind II和Nci I的限制性内切核酸酶(RE)识别；TRERS可由Bpm I或Mme I识别；双链核酸分子是至少部分通过向双链目标核酸片段连接在此处描述的连接物分子并整合NARS而进行的，且可选择地，双链目标核酸片段在与连接物连接之前用限制性内切核酸酶(RE)进行切割，且同样可选择地，双链目标核酸片段是cDNA片段，该cDNA片段可选择地固定于固体支持体上，且该固定的cDNA可选择地是通过一定方法产生的，该方法包含(i)用固定的寡核苷酸引物从生物学样品中分离mRNA；和(ii)用mRNA作为模板合成双链cDNA；扩增是在DNA聚合酶的存在下进行的，该DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的一种或由其两种或更多组成的任何组合，如聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；扩增是在等温条件下进行的；扩增的单链核酸片段含有不超过25个核苷酸；单链核酸片段长度为15-50个核苷酸；单链核酸片段长度为51-20,000个核苷酸。
另一方面，本发明提供了扩增单链核酸分子的方法，该方法包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)目标核酸；和(ii)寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物(a)包括可由切割剂(NA)识别的双链切割剂识别序列(NARS)有义链的核苷酸序列，该切割剂在位于识别序列之外的切割位点(NS)进行切割，和(b)包括至少基本与目标核酸互补的核苷酸序列。(B)用目标核酸的部分作为模板，在切割剂存在时扩增单链核酸分子。可选择地，双链切割剂识别序列可由N.BstNB I识别。可选择地，当寡核苷酸引物与目标核酸退火时，双链切割剂识别序列有义链的核苷酸序列内的一个核苷酸与目标核酸的另一个核苷酸不形成常规的碱基配对。可选择地，当寡核苷酸引物与目标核酸退火时，双链切割剂识别序列有义链的核苷酸序列内的两个或更多核苷酸与目标核酸的核苷酸不形成常规的碱基配对。可选择地，目标核酸是固定的。可选择地，寡核苷酸引物是在其5’末端固定的。
另一方面，本发明提供了方法，包括(A)形成混合物，该混合物包括(i)目标核酸；(ii)寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物(a)包括可由切割剂识别的NARS有义链的核苷酸序列，该切割剂在识别序列之外进行切割，和(b)是至少基本与目标核酸的第一个区域互补的；和(iii)部分双链的核酸，该部分双链的核酸(a)包含双链的IIs型限制性内切核酸酶识别序列，和(b)至少基本与位于第一个区域5’的目标核酸的第二个区域互补的3’突出端。这些成分在一定条件下进行组合，该条件使得寡核苷酸引物和目标的第一个区域之间及部分双链的核酸的3’突出端和目标的第二个区域之间能够进行杂交。(B)消化与寡核苷酸引物和第二个区域中的部分双链的核酸杂交的目标核酸。(C)用步骤(B)中消化的目标核酸的部分作为模板，在切割剂存在时扩增单链核酸分子。在相关的实施方案中，本发明提供了方法，包括(A)形成混合物，该混合物包含(i)目标核酸；(ii)寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物(a)包含可由切割剂识别的NARS有义链的核苷酸序列，该切割剂在识别序列之外进行切割，和(b)是至少基本与目标核酸的第一个区域互补的；和(iii)单链核酸分子，该单链核酸分子(1)是至少基本与位于第一个区域5’的目标核酸的第二个区域互补的。这些成分在一定条件下进行组合，该条件使得寡核苷酸引物和目标的第一个区域之间及单链核酸分子和目标的第二个区域之间能够进行杂交。(B)用目标核酸的部分作为模板，在切割剂和DNA聚合酶存在时扩增单链核酸分子。优选地，该DNA聚合酶不具有链置换活性，从而实际上单链核酸分子阻断了由DNA聚合酶进行的进一步的延伸反应。根据本发明的这些方面，优选地在等温条件下产生了多个单链核酸分子，该单链核酸分子优选地具有比基于目标核酸分子的长度可产生的全长更短的长度。在一个实施方案中，在NARS中有一个错配的碱基对，而在另一个实施方案中，在NARS中有两个错配的碱基对，而在另一个实施方案中，形成NARS的所有碱基对均是错配的，而在另一个实施方案中，形成NARS的n-1个碱基对是错配的，其中n碱基对形成NARS。在一个实施方案中，在NARS中有一个未配对的核苷酸。在另一个实施方案中，形成NARS有义链的所有核苷酸是未配对的。
另一方面，本发明提供了方法，包括(a)形成以下组分的混合物(i)包含切割剂识别序列(NARS)的部分或完全双链的模板核酸分子，(ii)识别NARS的切割剂(NA)，(iii)DNA聚合酶，和(iv)一种或多种脱氧核苷三磷酸。(b)在一定条件下维持步骤(a)中的混合物，该条件使得能够扩增单链核酸片段，在该条件下，单链核酸片段在不存在任何DNA聚合酶或链置换促进剂的链置换活性时能够自发地从模板核酸中解离。在相关方面，本发明提供了方法，包括(a)使部分或完全双链的模板核酸与切割剂(NA)接触，该模板包含切割剂识别序列(NARS)。(b)如果模板不包含可由NA切割的切割位点(NS)，则延伸模板以提供NS。(c)在NS切割模板或其延伸产物以提供在NS包含新3’末端的切割产物和在NS包含新的5’末端的切割产物；其中在NS包含新5’末端的切割产物和包含NARS反义链序列的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度比在NS包含新3’末端的切割产物和相同的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的高。(d)延伸在NS包含新3’末端的步骤(c)中的切割产物。(e)重复步骤(c)和(d)以扩增单链核酸片段。可选择地，切割、延伸和/或扩增是在等温条件下进行的。可选择地，步骤(b)、(c)、(d)和(e)进行的温度处于在NS包含新5’末端的切割产物和包含NARS反义链序列的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度和在NS包含新3’末端的切割产物和相同的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度之间。
只要单链核酸片段是由本发明任何方法中的扩增步骤形成的，且特别地(但不是必需的)当该单链核酸片段含有目标信息时，如在特定位置具有特定核苷酸，或具有特定核苷酸序列，其中该信息使得能够允许进行确定，那么在本发明方法的各个实施方案中，单链核酸片段具有至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸。此外，由本发明的扩增步骤形成的单链核酸片段可表征为含有不超过3个、或不超过4个、或不超过5个、或不超过6个、或不超过7个、或不超过8个、或不超过9个、或不超过10个、或不超过11个、或不超过12个、或不超过13个、或不超过14个、或不超过15个、或不超过16个、或不超过17个、或不超过18个、或不超过19个、或不超过20个、或不超过21个、或不超过22个、或不超过23个、或不超过24个、或不超过25个、或不超过26个、或不超过27个、或不超过28个、或不超过29个、或不超过30个、或不超过31个、或不超过32个、或不超过33个、或不超过34个、或不超过35个、或不超过36个、或不超过37个、或不超过38个、或不超过39个、或不超过40个、或不超过41个、或不超过42个、或不超过43个、或不超过44个、或不超过45个、或不超过46个、或不超过47个、或不超过48个、或不超过49个、或不超过50个核苷酸。
当消化产物是在本发明的任何方法中形成的时，那么在各个实施方案中，消化产物具有至少8个、或至少10个、或至少12个、或至少14个、或至少16个、或至少18个、或至少20个、或至少22个、或至少24个、或至少26个、或至少28个、或至少30个、或至少32个、或至少34个、或至少36个、或至少38个、或至少40个、或至少42个、或至少44个、或至少46个、或至少48个、或至少50个、或至少52个、或至少54个、或至少56个、或至少58个、或至少60个、或至少62个、或至少64个、或至少66个、或至少68个、或至少70个、或至少72个、或至少74个、或至少76个、或至少78个、或至少80个、或至少82个、或至少84个、或至少86个、或至少88个、或至少90个、或至少92个、或至少94个、或至少96个、或至少98个、或至少100个核苷酸；当形成了消化产物时，在各个实施方案中，消化产物具有不超过200个、或不超过180个、或不超过160个、或不超过140个、或不超过120个、或不超过110个、或不超过100个、或不超过90个、或不超过80个、或不超过70个、或不超过60个、或不超过50个、或不超过40个、或不超过38个、或不超过36个、或不超过34个、或不超过32个、或不超过30个、或不超过28个、或不超过26个、或不超过24个、或不超过22个、或不超过20个、或不超过18个、或不超过16个、或不超过14个、或不超过12个、或不超过10个核苷酸。
在包括NARS的本发明的任何方法或化合物或组合物中，该NARS可含有一个或多个错配的核苷酸。换句话说，形成NARS的一个或多个核苷酸碱基对可能不根据常规的沃森-克里克碱基配对法则进行杂交。然而，当错配碱基存在于NARS中时，那么至少所有形成NARS有义链的核苷酸是存在的。
当本发明的任何方法需要使用修饰的脱氧核苷三磷酸时，那么在一个实施方案中，修饰的脱氧核苷三磷酸是α-硫代脱氧核苷三磷酸。
当在本发明的任何方法中使用DNA聚合酶时，该DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的任何一种或多种，一个适当的DNA聚合酶的组合可通过对所列的这些聚合酶的任何2种、或任何3种、或任何4种等进行组合而形成，如聚合酶可选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶。
除上文简述的和在此处更详细描述的方法、试剂盒和组合物之外，本发明在下面也提供了可用于或可由本发明的方法和试剂盒生成的化合物、组合物和试剂盒部分双链的寡核苷酸探针，该探针包括(a)可由切割剂(NA)识别的切割剂识别序列(NARS)，该NA将在切割位点(NS)切割该探针或其延伸产物，(b)或者(i)在含有NS的链中的5’突出端，其中该突出端包括至少基本与目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或(ii)在不含有NS的链中的3’突出端，其中该突出端包括至少基本与目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；和(c)在既不含有NS也不能进行延伸以含有NS的探针链中的核苷酸序列，该核苷酸序列位于相应于NS的位置的5’，且该核苷酸序列唯一地与目标核酸相关，其中该突出端至少基本与所述目标核酸互补。该探针在下面的方法中是特别有用的，在该方法中使怀疑含有目标核酸的检验样品与探针进行组合；不与样品中的核酸进行杂交的探针可以和与样品中的核酸进行杂交的探针分离；然后用切割剂和聚合酶对与样品中的核酸进行杂交的探针进行处理以扩增单链核酸片段，该单链核酸片段含有唯一地与样品中的核酸相关的核苷酸序列；且对扩增的核酸片段进行表征以至少确定其核苷酸序列是唯一与样品中该核酸的存在相关的序列。例如，可将目标或探针进行固定，然后将非固定的目标(当探针固定时)或非固定的探针(当目标固定时)与固定的材料进行组合，然后将未固定的或没有与固定材料杂交的任何材料洗掉，并根据本发明对固定的材料进行重复切割和延伸以提供扩增的单链核酸片段，然后对扩增的单链片段进行表征以至少鉴定存在于探针中的唯一与目标相关的核苷酸序列的互补链，然后确定目标(即设计探针以与其“唯一相关”的目标)是否存在于样品中。本质上，唯一与目标核酸相关的探针中的核苷酸序列是特定目标核酸的有效的特异性信号。在一方面，本发明提供了一种化合物，其中目标核酸与探针是杂交的。另一方面，本发明提供了一种化合物，其中目标核酸固定于固体支持体上并与探针杂交。另一方面，本发明提供了固定于固体支持体上的探针。另一方面，本发明提供了固定于固体支持体上的探针和与探针进行杂交的目标核酸。在本发明的各个实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述探针和/或探针与目标的杂交产物目标核酸是变性的双链核酸的一条链，而双链核酸可为如基因组核酸和/或可为cDNA；目标核酸源自病原病毒的基因组；目标核酸源自病原细菌的基因组；目标核酸源自病原细菌的附加体；探针的双链区域长度为10-22个、或11-21个、或12-20个、或13-19个、或8-25个、或8-30个、或8-35个、或10-25个、或10-30个、或10-35个核苷酸；探针在不含有NS的链中具有3’突出端；探针在含有NS的链中具有5’突出端；5’突出端或3’突出端长度为5-25个、或6-22个、或8-20个、或10-18个核苷酸；探针含有少于200个核苷酸；探针含有少于150个核苷酸；探针含有少于100个核苷酸；探针含有少于90个、或少于80个、或少于70个、或少于60个、或少于50个核苷酸；探针含有至少20个、或至少21个、或至少22个、或至少23个、或至少24个、或至少25个、或至少26个、或至少27个、或至少28个、或至少29个、或至少30个核苷酸；NS可由切割性内切核酸酶切割；NS可由N.BstNB I切割；本发明也提供了包括多个上述的唯一探针的组合物，其中该探针由于其具有根据探针的特性(c)的序列而是唯一的，即与组合物中的其他探针不同，该探针唯一地以某种方式与目标核酸相关，该方式不同于任何其他探针与特定目标核酸相关的方式，或者该探针具有与目标核酸唯一相关的序列，而组合物中无其他探针也与该特定目标核酸相关。在一方面，这多个探针是以阵列形式组织的，如该多个探针是在支持体上的不同限定位置固定于固体支持体上的。
一对寡核苷酸引物(ODNP)，或包括一对ODNP的试剂盒或组合物，该引物对定义为第一个ODNP和第二个ODNP，其中(a)第一个ODNP至少部分是由至少基本与位于单链目标核酸中限定位置3’的核苷酸序列互补的核苷酸序列形成的，(b)第二个ODNP至少部分是由至少基本与存在于目标核酸互补链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列形成的，其中存在于互补链中的该核苷酸序列位于限定位置互补链的3’；(c)第一个和第二个ODNP进一步包括中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，完整的IRERS是从第一条和第二条链形成的双链核酸序列，其中第一个和第二个CRS由可变识别序列(VRS)连接，和(d)第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。除可在此处阐明的其他标准之外，下面的标准可进一步用于描述单独的ODNP，或存在于组合物或试剂盒中的ODNP，可将这些标准的任何两个或多个进行组合以描述ODNP至少基本与目标核酸互补的第一个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个核苷酸；至少基本与目标核酸的互补链互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或1 3个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个核苷酸；第一个ODNP长度为15-85个、或16-70个、或17-60个、或18-50个、或18-40个、或20-30个、或15-30个、或15-40个、或15-50个核苷酸；第二个ODNP长度为15-85个、或16-70个、或17-60个、或18-50个、或18-40个、或20-30个、或15-30个、或15-40个、或15-50个核苷酸；第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的第一个CRS的3’末端的核苷酸互补的一个或多个核苷酸；第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的第二个CRS的3’末端的核苷酸互补的一个或多个核苷酸；单链目标核酸是双链核酸的一条链；而双链核酸可为如基因组核酸和/或可为cDNA；目标核酸源自病原病毒的基因组；目标核酸源自病原细菌的基因组；目标核酸源自病原细菌的附加体。该组合物可进一步包含目标核酸和/或目标核酸的互补链。该组合物或试剂盒可进一步包括一种或多种识别IRERS的限制性内切核酸酶；Bsl I；识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)；N.BstNB I；DNA聚合酶；运行ODNP测定法的适当缓冲液；和使用试剂盒的说明书。例如，本发明提供了基因型试剂盒，该试剂盒包括刚刚描述的引物对，以及识别NERS的NE、识别IRERS的RE、DNA聚合酶和使用试剂盒的说明书。
包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物。本发明提供了连接物、含有该连接物的试剂盒、使用该连接物的方法和含有该连接物的组合物。在本发明的各个实施方案中，下面的标准可用于进一步表征连接物，而任何两个或更多标准可进行组合，这些标准仅仅是示例性的并补充在文中别处阐明的任何标准它含有NARS的有义和反义序列两者；它含有双链切割位点(NS)，在该位点仅仅一条链被识别NARS的切割剂切割；它含有少于200个、或少于175个、或少于150个、或少于125个、或少于100个、或少于90个、或少于80个、或少于70个、或少于65个、或少于60个、或少于55个、或少于50个、或少于45个、或少于40个、或少于35个、或少于30个、或少于25个、或少于20个核苷酸；它含有超过10个、或超过15个、或超过20个、或超过25个、或超过30个、或超过35个、或超过40个、或超过45个、或超过50个核苷酸；它含有用于与目标核酸连接的3’突出端；它含有用于与目标核酸连接的5’突出端；它含有用于与目标核酸连接的平端；它是固定于固体支持体上的，它是通过连接物的3’末端固定于固体支持体上的；它是通过连接物的5’末端固定于固体支持体上的；NARS可由切割性内切核酸酶识别；NARS可由N.BstNB I识别；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶识别序列；NARS可由选自AvaI、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4HI、Hinc II、Hind II和Nci I的限制性内切核酸酶(RE)识别；连接物设计为，当连接物与双链目标核酸片段连接时，目标核酸链位于NARS的部分的5’，该NARS的部分位于不含有NS的连接物的链中；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点同时位于(i)双链目标核酸片段中，和(ii)相应于由NA切割的NS的位置的5’；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)且该TRERS位于含有NS链的NARS的5’；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)且该TRERS位于含有NS的链中NARS的3’；它含有可由Bpm I识别的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；它含有可由Mme I识别的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)。本发明也提供了包括连接物的组合物和试剂盒。该组合物和试剂盒可用于如合成如在此处所述的寡核苷酸探针。除连接物之外，组合物和试剂盒的可选择成分包括一种或多种识别NARS的切割剂；识别NARS的切割性内切核酸酶(NE)；NE的缓冲液；识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶；IIs型限制性内切核酸酶的缓冲液；DNA聚合酶(如选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和/或exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶)；DNA聚合酶的缓冲液；可连接连接物与目标核酸的连接酶；DNA连接酶的缓冲液；使用试剂盒的说明书；固定于固体支持体上的包含poly(dT)寡核苷酸的引物；反转录酶；链置换促进剂，如海藻糖。本发明也提供了包含连接物和双链目标核酸的组合物。可选择地，双链目标核酸片段是cDNA片段。可选择地，双链目标核酸是固定于固体支持体上的。可选择地，该组合物进一步包括连接酶和/或聚合酶和/或限制性内切核酸酶和/或切割性内切核酸酶。例如，本发明提供了包含(a)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；和(b)切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物，其中当该连接物与双链目标核酸片段连接时，在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，目标核酸片段位于NARS的5’，那么识别该链中的TRERS(如果TRERS存在)的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点则同时位于(i)双链目标核酸片段中，和(ii)相应于NS的位置的5’。
可用于合成单链cDNA分子的模板核酸分子。该模板核酸分子包括(a)可表征为源自双链cDNA分子或其片段的部分；和(b)可表征为源自核酸连接物的部分，其中(a)部分连接到(b)部分。核酸连接物(b)部分包括切割剂识别序列(NARS)。在同时存在(i)模板核酸分子，(ii)识别NARS的切割剂(NA)和(iii)DNA聚合酶时，扩增了单链分子，其中该单链分子的至少部分具有与双链cDNA的一条链核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列。优选地，该部分长度为至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸。下面的标准可单独或以任何组合用于进一步表征本发明的模板核酸分子识别NARS的NA是切割性内切核酸酶(NE)；识别NARS的NA是N.BstNB I；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶。可选择地，模板核酸分子的至少一条链固定于固体支持体上。该固定可例如通过双链cDNA分子或核酸连接物的末端进行，该末端现在不、过去不且将来也不参与双链cDNA分子和核酸连接物之间的连接。可选择地，在固体支持体和固定于固体支持体上的模板核酸分子的末端之间可存在连接体分子。可选择地，在固体支持体和最直接固定于固体支持体上的模板核酸分子的末端之间可存在连接体半分子，该连接体包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的序列。许多这种模板核酸分子可用于形成cDNA文库。在一个实施方案中，形成文库的许多模板核酸分子中的每一个都固定于固体支持体上。可选择地，在该文库中，识别NARS的NA是切割性内切核酸酶(NE)，如N.BstNB I。可选择地，如已经提及的，NARS可为半修饰的限制性内切核酸酶。
本发明的这些和相关方面及实施方案将在下文中更详细地进行阐明。
附图简述
图1是本发明方法中主要步骤的示意图，该方法用于用示例性的ODNP对在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异，该ODNP对分别含有切割性内切核酸酶识别序列(NERS)有义链的序列和IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)一条链的序列，图2是本发明方法中主要步骤的示意图，该方法用于用各自含有NERS有义链的序列的示例性ODNP对在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异。
图3是本发明方法中主要步骤的图示，该方法使用ODNP对、作为示例性IRERS的Bst I和作为示例性NERS的N.BstNB I在目标核酸的限定位置鉴定核苷酸。
图4是中断的限制性内切核酸酶识别序列主要成分的示意图。A1A2...Am是由m个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，而A’1A’2...A’m是A1A2...Am的互补链序列。由A1A2...Am和A’1A’2...A’m组成的双链片段形成了第一个CRS。N1N2...Nn是由n个核苷酸组成的可变核苷酸序列，其中核苷酸的任何一个都可含有四个碱基的任何一个(A、C、T或G)。N’1N’2...N’n是N1N2...Nn的互补链并与N1N2...Nn组合形成了VRS。C1C2...Ci是由i个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，而C’1C’2...C’i是C1C2...Ci的互补链。由C1C2...Ci和C’1C’2...C’i组成的双链片段形成了第二个CRS。
图5是本发明方法中主要步骤的示意图，该方法使用各自含有半修饰的RERS有义链的序列的示例性ODNP对在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异。虚线代表具有整合的修饰脱氧核苷酸的延伸/扩增产物。
图6是本发明用于探测生物学样品中目标核酸存在与否的方法中主要步骤的示意图。
图7是从对4-聚体ODN(5’-ACGA-3’)的1∶10稀释物的电喷射-液相-层析/质谱分析法-飞行时间(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图8是从对4-聚体ODN(5’-ACGA-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图9是从对4-聚体ODN(5’-ACGA-3’)的1∶1000稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图10A和10B是从对6-聚体ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶10稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图11是从对6-聚体ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图12是从对6-聚体ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶1000稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图13A和13B是从对8-聚体ODN(5’-ACGATGCA-3’)的1∶10稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图14是从对8-聚体ODN(5’-ACGATGCA-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图15A和15B是从对10-聚体ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶10稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图16是从对10-聚体ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图17是从对10-聚体ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶1000稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图18是一套4个、6个、8个和10个核苷酸的ODNP的高压液相层析(HPLC)的层析谱。
图19A和19B表示对3个8-聚体(图19A)和3个10-聚体(图19B)的HPLC分级分离和探测。
图20A和20B表示对1个4-聚体、1个6-聚体、3个8-聚体和3个10-聚体的HPLC分离(图20A)和对2个6-聚体的洗脱(图20B)。
图21是PCR反应产物用N.BstNB I和Bsl I两者消化后的UV层析谱。箭头显示单链核酸消化产物。
图22A和22B分别是PCR反应产物用N.BstNB I和Bsl I两者消化后的单个离子层析谱和总离子层析谱。
图23表示用N.BstNB I和Bsl I双消化从双链PCR产物中切割的单链寡核苷酸的质谱。
图24A和24B表示从一个个体的基因组DNA中扩增的序列5’-GAGCACAGGATG-3’(顶部链)和5’-CATCCTGTGCTC-3’(底部链)的UV层析谱(图24A)和抽取(extracted)的离子流图(图24B)。
图25A和25B表示从另一个个体的基因组DNA中扩增的序列5’-GAGCACAGGATG-3’(顶部链)和5’-CATCCTGTGCTC-3’(底部链)的UV层析谱(图25A)和抽取(extracted)的离子流图(图25B)。
图26A和26B表示无模板对照中的UV层析谱(图26A)和抽取的离子流图(图26B)。
图27A和27B表示顶部片段(m/z＝3@1265amu)(图27B)和底部片段(m/z＝3@1216amu)(图27A)的质谱。
图28是本发明用于制备单链核酸探针的示例性方法中主要步骤的示意图。固定的poly(dT)探针用于分离mRNA并充当合成cDNA的引物。然后使合成的cDNA与本发明的示例性连接物连接，该连接物包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)和IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)。然后将连接的核酸片段用IIs型限制性内切核酸酶消化并用作模板以在DNA聚合酶和识别核酸连接物中的NERS的切割性内切核酸酶存在时合成短的单链核酸探针。
图29A-H是示例性连接物和目标核酸的连接产物的示意图。目标核酸由虚线代表。TRERS(“IIs型限制性内切核酸酶识别序列”的缩写)上面或下面的箭头显示从TRERS到识别TRERS的限制性内切核酸酶(RE)的切割位点的方向。同样地，NERS(“切割性内切核酸酶识别序列”的缩写)上面或下面的箭头显示从NERS到识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点的方向。
图30A和30B表示本发明方法中主要步骤的示意图，该方法用于确定目标cDNA分子中特定外显子-外显子连接(Exon A和Exon B之间的连接)的存在(图30A)或不存在(图30B)。
图31A-C表示用于本发明确定源自目标基因的cDNA中每一个外显子-外显子连接存在与否的方法中主要步骤的示意图。图31A是用于本发明方法中的目标基因和两套ODNP的示意图。虚线代表未显示的基因部分。图31B是目标cDNA分子(目标cDNA I)和扩增的模板核酸片段的示意图。图31C是另一个目标cDNA(目标cDNA II)和扩增的模板核酸片段的示意图。
图32表示源自1号个体的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互补核苷酸的扩增单链片段的质谱分析，该1号个体对于A等位基因是纯合的。上面的试验组表示含有T等位基因的互补核苷酸的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示含有T等位基因的片段(称为“T等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示含有A等位基因的互补核苷酸的片段(称为“A等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示含有A等位基因的片段(称为“A等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。
图33表示源自2号个体的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互补核苷酸的扩增单链片段的质谱分析，该2号个体对于A和T等位基因是杂合的。上面的试验组表示含有T等位基因的互补核苷酸的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示含有T等位基因的片段(称为“T等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示含有A等位基因的互补核苷酸的片段(称为“A等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示含有A等位基因的片段(称为“A等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。
图34表示源自样本的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互补核苷酸的扩增单链片段的质谱分析，该样本取自200个对于A等位基因是纯合的个体和1个对于T等位基因是纯合的个体。上面的试验组表示含有T等位基因的互补核苷酸的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示含有T等位基因的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示含有A等位基因的互补核苷酸的片段(称为“A等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示含有A等位基因的片段(称为“A等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。
图35表示对与图34中相同的扩增寡核苷酸片段在2.5分钟和5分钟之间的二极管阵列追踪(UV追踪)(上面试验组)与总离子流(下面试验组)。
图36表示通过使源自基因组DNA的引发核酸与单链核酸探针退火及随后扩增单链核酸分子而制备模板核酸分子的主要步骤的示意图。
图37表示从基因组DNA制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。该基因组DNA包含切割剂识别序列。该模板分子是通过使基因组DNA片段的一条链与单链核酸探针退火而制备的，该单链核酸探针是基因组DNA片段的另一条链的部分。
图38表示从基因组DNA制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。该基因组DNA包含切割剂识别序列和限制性内切核酸酶识别序列。将可在其识别序列之外进行切割的切割性内切核酸酶所识别的切割性内切核酸酶识别序列用作示例性的切割剂识别序列。
图39表示用两个寡核苷酸引物从目标核酸制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。一个引物包含NERS有义链的序列而另一个引物包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)的一条链。
图40表示用两个ODNP制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。在该示例性的实施方案中，两个ODNP均包含NERS有义链的序列。
图41表示在示例性的实施方案中用两个ODNP制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。两个ODNP均包含RERS一条链的序列。该扩增是在用作示例性的修饰脱氧核苷三磷酸的α-硫代脱氧核苷三磷酸存在时进行的。
图42表示用包含NARS反义链序列的单链核酸探针探测固定的目标核酸的方法的示意图。
图43表示用包含切割剂识别序列有义链序列的寡核苷酸引物扩增单链核酸分子的方法的示意图。
图44表示用固定的单链核酸探针探测目标核酸存在的方法的示意图，该单链核酸探针包含NARS有义链的序列和至少基本与目标核酸3’部分互补的序列。
图45表示用固定的单链核酸探针探测目标核酸存在的方法的示意图，该单链核酸探针包含NARS有义链的序列和至少基本与目标核酸互补的序列。
图46表示用寡核苷酸引物扩增单链核酸分子的方法的示意图，该寡核苷酸探针包含切割剂识别序列有义链的序列和包含双链IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)的部分双链的核酸分子。
发明详述本发明提供了用于扩增单链核酸片段的方法、组合物和试剂盒，该扩增方法用于如鉴定遗传变异；制备寡核苷酸探针；和探测生物学样品中的核酸存在与否，和cDNA和mRNA中外显子之间连接的存在与否。该扩增是通过组合(a)包含切割剂识别序列(NARS)的模板双链核酸和(b)识别NARS的切割剂(NA)的识别位点(NS)而进行的。然后用切割剂在NS对双链核酸模板进行切割以借此在NS生成3’末端。在5’→3’外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶存在时，延伸了NS的3’末端，从而替换了下游的单链DNA片段(即在NS具有5’末端的单链DNA片段)。然后用切割剂切割延伸产物，并将这样在NS形成的3’末端再次用DNA聚合酶进行延伸以形成另一个延伸产物。使该切割-延伸过程重复多次，从而导致具有由切割剂在NS生成的5’末端的单链DNA片段的扩增。
在各个方面，本发明在各个有用的应用中使用上述扩增方法，该应用包括在目标核酸中鉴定遗传变异、寡核苷酸探针的制备和探测生物学样品中特定核酸的存在与否或者cDNA或mRNA分子或群体中特定外显子-外显子连接的存在与否。这种应用在许多方面是有用的，包括遗传疾病的遗传分析、肿瘤或病原体诊断、鉴定疾病的诱因、法律、亲子确定、创建和监控作物培养或动物优质育种项目、细胞功能和/或疾病标记基因的表达描述、鉴定和/或表征在植物或动物中导致传染性疾病和/或与食品安全相关的传染性生物。
A.规定/定义在提供对本发明更详细的描述之前，如在下文中定义一些在此处所用的规定和术语对于理解是有帮助的。额外的定义可在贯穿本发明的描述中发现。
术语“3’”和“5’”在此处用于描述核酸单链中特定位点的位置。当核酸中的位置为参考核苷酸或参考核苷酸序列“3’”时，这意味着该位置在参考核苷酸或参考核苷酸序列的3’末端和该核酸链的3’羟基之间。同样地，当核酸中的位置为参考核苷酸或参考核苷酸序列“5’”时，这意味着该位置在参考核苷酸或参考核苷酸序列的5’末端和该核酸链的5’磷酸之间。进一步地，当所讨论核酸序列为参考核苷酸或参考核苷酸序列的“直接3’”时，这意味着该所讨论核酸序列直接邻接参考核苷酸或参考核苷酸序列的3’末端。类似地，当所讨论核酸序列为参考核苷酸或参考核苷酸序列“直接5’(5’to)”或“的直接5’(5’of)”，这意味着该所讨论核酸序列直接邻接参考核苷酸或参考核苷酸序列的5’末端。
如在此处所用的，“切割”指在相对于由进行切割的酶识别的核苷酸序列的特定位置对双链核酸分子的仅仅一条链或部分双链核酸分子的双链部分的切割。将核酸进行切割的该特定位置称为“切割位点”(NS)。
“切割剂”(NA)是识别完全或部分双链核酸分子的特定核苷酸序列并仅在相对于识别序列的特定位置切割核酸分子的一条链的酶。当双链(或部分双链的)核酸分子含有半修饰的识别/切割序列时，其中一条链含有至少一个阻止限制性内切核酸酶对该链(即含有衍生的核苷酸的链)进行裂解的衍生的核苷酸，该切割剂包括但不局限于切割性内切核酸酶(如N.BstNB I)和限制性内切核酸酶(如Hinc II)。
如在此处所用的，“切割性内切核酸酶”(NE)指识别完全或部分双链核酸分子的核苷酸序列并仅在相对于识别序列的特定位置对核酸分子的一条链进行切割的内切核酸酶。与限制性内切核酸酶(RE)不同，该限制性内切核酸酶(RE)需要其识别序列通过含有至少一个衍生的核苷酸而进行修饰以阻止对完全或部分双链核酸分子含有衍生的核苷酸的链进行切割，NE一般识别仅包含天然核苷酸的核苷酸序列并仅在含有该核苷酸序列的完全或部分双链核酸分子的一条链进行切割。
如在此处所用的，“天然核苷酸”指腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、胸苷酸或尿苷酸。“ 衍生的核苷酸”指除天然核苷酸之外的核苷酸。
完全或部分双链的核酸分子中被NA识别的核苷酸序列称为“切割剂识别序列”(NARS)。同样地，完全或部分双链的核酸分子中被NE识别的核苷酸序列称为“切割性内切核酸酶识别序列”(NERS)。RE识别的特定序列称为“限制性内切核酸酶识别序列”(RERS)。如在此处所用的，“半修饰的RERS”指双链RERS，其中识别序列的一条链含有至少一个衍生的核苷酸(如α-硫代脱氧核苷酸)，该衍生的核苷酸阻止识别RERS的RE对该链(即在识别序列含有衍生的核苷酸的链)进行裂解。
在某些实施方案中，NARS是双链核苷酸序列，其中序列的一条链中的每一个核苷酸均与另一条链中相应位置的核苷酸互补。在这种实施方案中，含有可由识别NARS的NA切割的NS的链中的NARS序列称为“NARS有义链的序列”或“双链NARS有义链的序列”，而不含有NS的链中的NARS序列称为“NARS反义链的序列”或“双链NARS反义链的序列”。
同样地，在NERS是其中一条链精确地与另一条链互补的双链核苷酸序列的实施方案中，位于含有可由识别NERS的NE切割的NS的链中的NERS序列称为“NERS有义链的序列”或“双链NERS有义链的序列”，而位于不含有NS的链中的NERS序列称为“NERS反义链的序列”或“双链NERS反义链的序列”。例如，示例性切割性内切核酸酶N.BstNB I的识别序列和切割位点如下面所示，“”指示切割位点且N指示任何核苷酸5′-GAGTCNNNNN-3′3′-CTCAGNNNNN-5′N.BstNB I识别序列有义链的序列为5’-GAGTC-3’，而反义链的为5’-GACTC-3’。
类似地，含有可由识别半修饰的RERS(即不含有任何衍生的核苷酸的链)的RE切割的NS的链中的半修饰RERS序列称为“半修饰RERS有义链的序列”并位于“半修饰RERS有义链”中，而位于不含有NS的链(即含有衍生的核苷酸的链)中的半修饰RERS序列称为“半修饰RERS反义链的序列”并位于“半修饰RERS反义链”中。
在某些其他的实施方案中，NARS是具有一个或多个核苷酸错配的至多部分双链的核苷酸序列，但含有如上所述的双链NARS的完整有义链。根据此处所用的规定，在描述NARS的上下文中，当两个核酸分子相互退火从而形成杂交产物时，且该杂交产物包括NARS时，且在杂交产物的NARS中有至少一个错配的碱基对时，则认为该NARS是仅仅部分双链的。这种NARS可由某些切割剂(如N.BstNB I)识别，该切割剂仅需要双链识别序列的一条链来发挥其切割活性。例如，在某些实施方案中，N.BstNB I的NARS可含有如下完整有义链5′-GAGTC-3′3′-NNNNN-5′其中N指示任何核苷酸，且一个位置上的N可以与另一个位置上的N相同或不同，然而在该识别序列中有至少一个错配碱基对。在该情况下，可将NARS表征为具有至少一个错配的核苷酸。
在某些其他的实施方案中，NARS是具有一个或多个未配对核苷酸的部分或完全单链核苷酸序列，但含有如上所述的双链NARS的完整有义链。根据此处所用的规定，在描述NARS的上下文中，当两个核酸分子(即第一链和第二链)相互退火从而形成杂交产物时，且该杂交产物在第一链中包括由NA识别的核苷酸序列时(即杂交产物含有NARS时)，且当形成杂交产物时由NA识别的序列中至少一个核苷酸不相应于第二链中的核苷酸(即不在第二链中核苷酸的对面)，则在杂交产物的NARS中有至少一个未配对的核苷酸，且认为该NARS是部分或完全单链的。这种NARS可由某些切割剂(如N.BstNB I)识别，该切割剂仅需要双链识别序列的一条链来发挥其切割活性。例如，在某些实施方案中，N.BstNB I的NARS可含有如下完整有义链5′-GAGTC-3′3′-N0-4-5′(其中“N”指示任何核苷酸，0-4指核苷酸“N”的数目，且一个位置上的“N”可以与另一个位置上的“N”相同或不同)，该链含有N.BstNB I的双链识别序列有义链的序列。在该情况下，G、A、G、T或C的至少一个是未配对的，从而在互补链中没有相应的核苷酸。例如在杂交产物中有“环”时，且特别地当在环中存在有义链(完全或部分)时，这种情况会产生。
在本发明的一些方面，扩增的单链核酸片段是长度为最多5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个核苷酸的单链核酸片段。这种片段的短的长度促进了通过各种技术对其进行探测和/或表征，包括质谱分析法和液相层析，如在下文详细描述的。然而，在一些方面的某些实施方案中(如制备单链核酸探针)，扩增的单链核酸片段相对较长，例如其长度可为51-1000个核苷酸。
位于“相应于”双链核酸另一条链(第二链)的位置(即限定位置)的位置的双链核酸的一条链(第一链)中的核苷酸指，当第一条和第二条链相互杂交从而形成双链核酸时与第二链中限定位置的核苷酸形成氢键并互补的第一链中的核苷酸。同样地，“相应于”双链核酸的另一条链(第二链)中的切割位点的双链核酸的一条链(第一链)中的位置指第一链中两个核苷酸之间的位置，该两个核苷酸与围绕切割位点的第二链中的两个核苷酸互补。
B.遗传变异的探测在一方面，本发明提供了探测目标核酸中遗传变异的方法、化合物和试剂盒。
1.探测遗传变异的方法本发明提供了在目标核酸的限定位置探测遗传变异的方法。该方法包含(a)提供包含目标核酸片段和位于遗传变异5’的切割位点(NS)的双链模板核酸；(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的切割剂存在时扩增包含遗传变异的单链片段，该单链片段的5’末端位于NS；和(c)表征单链片段并借此鉴定遗传变异。在一个实施方案中，单链片段是在切割性内切核酸酶存在时扩增的。在另一个实施方案中，该片段是在限制性内切核酸酶存在时扩增的。
至于使用切割性内切核酸酶的方法，双链模板核酸可通过首先形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和在限定位置含有遗传变异的目标核酸的混合物而提供。在目标核酸是双链的情况下，如图1所示，第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。第二个ODNP包含至少基本与位于目标核酸另一条链上的遗传变异的3’的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的核苷酸序列。
在目标核酸是单链的情况下，第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含RERS一条链的核苷酸序列。
用目标核酸作为模板对第一个和第二个ODNP的延伸产生了具有NERS和可选择地具有RERS的延伸产物，其中遗传变异位于NERS和RERS之间。该延伸产物是包含目标核酸片段和位于遗传变异5’的NS的想要的双链模板核酸。如果其含有RERS，那么延伸产物可用识别RERS的限制性内切核酸酶进行裂解，并在识别NERS的NE存在时用作扩增单链核酸分子的模板。否则，延伸产物可直接用作扩增单链核酸分子的模板。该方法的示例性过程如图1所示，其中用TRERS(IIs型限制性内切核酸酶识别序列)作为示例性的RERS。
可选择地，如图2所示，双链模板核酸可通过首先形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和在限定位置含有遗传变异的双链目标核酸的混合物而提供。第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。第二个ODNP包含NERS有义链的序列，而不是如上所述的RERS。用目标核酸作为模板对第一个和第二个ODNP的延伸产生了具有两个NERS的延伸产物。该延伸产物是包含目标核酸片段和位于遗传变异5’的NS的想要的双链模板核酸。然后该延伸产物可用作在识别NERS的NE存在时扩增单链核酸片段的模板，该单链核酸片段的5’末端位于NS。
至于使用限制性内切核酸酶切割双链核酸的方法，双链模板核酸可通过首先形成第一个ODNP、第二个ODNP和双链目标核酸的混合物而提供(图5)。在目标核酸是双链的情况下，第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而第二个ODNP包含第二个RERS一条链的序列和至少基本与位于限定位置3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在目标核酸是单链的情况下，第一个ODNP包含第一个RERS一条链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含第二个RERS一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时对第一个和第二个ODNP的延伸产生了具有第一个和第二个半修饰的RERS的片段。这种延伸产物可用作模板以在识别第一个RERS和第二个RERS的RE存在时扩增单链核酸分子。在某些实施方案中，第一个RERS与第二个RERS相同。因而，延伸产物可在识别第一个和第二个RERS两者的RE存在时进行扩增。
在所有上述的实施方案中，单链核酸分子的扩增是在切割剂和DNA聚合酶存在时实现的。该扩增的单链核酸分子含有目标核酸的遗传变异并进而进行了表征。借此鉴定了目标核酸的遗传变异。
a.目标核酸涉及鉴定遗传变异的本发明的目标核酸是任何如下核酸分子，该核酸分子用野生型核酸序列作为参考时可含有遗传变异，且可充当引物延伸反应的模板，即可与寡核苷酸引物形成碱基对。
术语“核酸”一般指整合了核糖核酸或其类似物单位的任何分子，优选地指多聚体分子。目标核酸可为单链或双链的。单链目标核酸可为变性的双链DNA的一条链。可选择地，它可为不源自任何双链DNA的单链核酸。在一方面，目标核酸是DNA。另一方面，目标是RNA。适当的核酸分子是DNA，包括基因组DNA、核糖体DNA和cDNA。其他适当的核酸分子是RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA。核酸分子可天然存在，如在基因组DNA中，或它可为合成的，即基于人工作用制备的，或者可为两者的组合。
在一方面，目标核酸是天然存在的核酸或者源自天然存在的核酸。天然存在的目标核酸是从生物学样品中获得的。优选的生物学样品包括一种或多种哺乳动物组织，优选地为人类组织(如血液、血浆/血清、毛发、皮肤、淋巴结、脾、肝等)和/或细胞或细胞系。生物学样品可包含一种或多种人类组织和/或细胞。哺乳动物和/或人类组织和/或细胞可进一步包含一种或多种肿瘤组织和/或细胞。
从生物学样品中分离核酸群体的方法是众所周知的且对于本发明领域中技术人员而言是易于获得的。示例性的技术描述于如下面的实验室研究手册中Sambrook等人，“Molecular Cloning”Cold SpringHarbor Press，3rdEdition，2001)和Ausubel等人，“Short Protocolsin Molecular Biology”(1999)(在此处整体引入作为参考)。核酸分离试剂盒在许多公司中也是商业上可购得的，且可用于简化和加速分离过程。
合成的目标核酸是通过人工干预生产的。目前，许多公司从事于制备和销售可用作本发明的目标核酸分子的合成核酸。这些公司可以或也将制备用于本发明的引物。参见如Applied Bio ProductsBionexus(www.bionexus.net)；Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA；www.cbi-biotech.com)；Gemini Biotech(Alachua，Florida；www.geminibio.com)；INTERACTIVABiotechnologie GmbH(Ulm，德国；www.interactiva.de)；Microsynth(Balgach，瑞士；www.microsynth.ch)；Midland Certified ReagentCompany(Midland，TX；www.mcrc.com)；Oligos Etc.(Wilsonyille，OR；www.oligosetc.com)；Operon Technologies Inc.(Alameda，CA；www.operon.com)；Scandanavian Gene Synthesis AB(Kping，瑞典；www.sgs.dna)；Sigma-Genosys(The Woodlands，Texas；www.genosys.com)；Synthetic Genetics(San Diego，CA；www.syntheticgenetics.com，由Epoch Biosciences，Inc.(Bothell，WA；www.epochbio.com)所有)；和许多其他的。
合成的核酸目标可用扩增反应制备。该扩增反应可为如聚合酶链反应(PCR)。
合成的核酸目标可用重组DNA方法通过在一种或多种原核或真核生物中制备，该生物如大肠杆菌(E.coli)、酵母、果蝇(Drosophila)或哺乳动物组织培养细胞系。
目标核酸分子可以且通常会含有一种或多种存在于核苷酸中的天然碱基，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和在RNA的情况下为尿嘧啶(U)。此外，且特别地当核酸是合成的分子时，目标核酸可包括“非天然的”核苷酸。非天然的核苷酸是化学半分子(moiety)，该半分子可替代核苷酸链中的一种或多种天然核苷酸而不导致核酸丧失其充当引物延伸反应模板的能力。该替代除碱基替代之外，可包括糖和/或磷酸替代。
这种半分子是本领域中众所周知的，且已知有许多名称，包括如无碱基核苷酸，该无碱基核苷酸不含有通常公认的核苷酸碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶(参见如Takeshita等人“Oligonucleotides containing synthetic abasic sites”TheJournal of Biological Chemistry，262卷，pp.10171-10179 1987；Iyer等人“Abasic oligodeoxyribonucleoside phosphorothioatessynthesis and evaluation as anti-HIV-1 agents”Nucleic acidsResearch，18卷，pp.2855-2859 1990；和美国专利6,117,657)；碱基或核苷酸类似物(参见如Ma等人，“Design and Synthesis ofRNA Miniduplexes via a Synthetic Linker Approach.2.Generationof Covalently Closed，Double-Stranded Cyclic HIV-1 TAR RNAAnalogs with High Tat-Binding Affinity”，Nucleic acids Research212585(1993)。一些碱基已知是通用的错配碱基类似物，如无碱基的3-硝基吡咯；convertides(参见如Hoops等人，Nucleic AcidsRes.254866-4871(1997)；修饰的核苷酸(参见如Millican等人，“Synthesis and biophysical studies of shortoligodeoxynucleotides with novel modificationsA possibleapproach to the problem of mixed base oligodeoxynucleotidesynthesis”，Nucleic acids Research 127435-7453(1984))；核苷酸模拟物；核酸相关化合物；间隔区(参见如Nielsen等人，Science 2541497-1500(1991)；和特异性间隔区(参见如PCT国际
发明者J·范尼斯, D·J·格拉斯, L·K·范尼斯 申请人:凯克研究生院
文档序号 :
【 409861 】
技术研发人员：J.范尼斯,D.J.格拉斯,L.K.范尼斯
技术所有人：凯克研究生院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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