一种利用蛋白支架提高酿酒酵母中鲨烯的合成方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高酿酒酵母中鲨烯合成的方法，即在酿酒酵母中将来源于大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶，来源于酿酒酵母的法尼基焦磷酸合成酶和鲨烯合酶，利用三对相互作用的蛋白质GBD，WH1，PDZ及其配基和多肽连接器，构建三个酶的人工多酶复合体，模拟天然底物隧道效应，减少传质阻力，提高酿酒酵母生产鲨烯的能力。本发明提供的鲨烯生产方法与化学提取法相比，成本低，操作简便，生产的鲨烯安全性高。
【专利说明】一种利用蛋白支架提高酿酒酵母中鲨烯的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种利用蛋白支架提高酿酒酵母中鲨烯的合成方法。
【背景技术】
[0002]鲨烯(squalene)又名角鲨烯、三十碳六烯、鱼肝油萜，化学名为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯，是一种高度不饱和烃类化合物，是萜类及固醇类化合物合成的重要前体物质。最初由日本化学家Tsujimoto于1906年在黑鲨鱼肝油中发现。鲨烯具有极强的供氧能力，在抑制癌细胞生成、扩散和缓解因化疗而导致的白细胞数量减少等方面具有显著的疗效，对胃癌、食道癌、肺癌，卵巢癌，具有显著的治疗作用。鲨烯还具有良好的抗感染，抗疲劳功效，主要应用于保健品和医疗卫生保健行业。
[0003]目前工业提取角鲨烯的方法是从鲨鱼肝油中提取。由于近年来人类对海洋生态的影响，海洋生态形势日趋严峻，海洋渔业资源濒临枯竭，因而使用动物油脂尤其是鲨鱼肝油中提取角鲨烯的传统工艺必定会逐渐淘汰。并且从海洋动物油脂中提取的角鲨烯带有难以去除的异味，致使其不利于作为添加剂加入到化妆品和保健食品中。因此传统的提取生产工艺必定会被其他生产方式所替代。长期以来，人们发现鲨烯在橄榄油、大豆油、米糠油中均有少量的分布，从植物中提取鲨烯生产成本过高，难以通过实现大规模的工业化生产以满足日益增长的市场需求。用化学合成的方法来合成鲨烯不仅步骤繁琐，而且得到的产物难以分离纯化，不能用于纯度要求极高的医药和保健品行业。因此，寻求一种生产成本低，分离提取简单高效的鲨烯大规模生产方法是十分必要的。
[0004]用微生物细胞生产鲨烯引起了科学家的关注。酿酒酵母作为一种模式微生物，不仅生长繁殖快，遗传背 景清楚，而且食品安全。酿酒酵母本身也是可以合成鲨烯的，但是鲨烯合成途径存在限速步骤，代谢分流，中间产物对细胞的毒害作用以及多酶催化传质阻力等问题，导致鲨烯的合成能力低，无法实现用微生物大量生产鲨烯。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为解决酿酒酵母生产鲨烯能力低的局限，提供一种利用通过蛋白支架共区域化鲨烯合成途径关键酶，从而提高酿酒酵母生产鲨烯能力的方法。
[0006]为达到上述目的，本发明人工化学合成经过密码子优化的GBD，WH1，PDZ三个蛋白结构域，通过两段多肽连接器将三个结构域按顺序做成一个融合蛋白。用来源于酿酒酵母的启动子FBAl和对应的终止子FBAl启动和终止该融合蛋白的转录。
[0007]克隆来自E.coli BL21(DE3)的异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)，来自Saccharomyces cerevisiae INVSCl的法尼基焦憐酸合酶(FPPS)和藍烯合酶(SQS),将GBD, WHl和I3DZ的配基分别通过多肽连接器与IDI，FPPS和SQS的N端或C端融合，做成三个融合蛋白。用三个来源于酿酒酵母的启动子Nam2，Alai, Gpml和对应的终止子Nam2，Alal，Gpml分别启动和终止三个融合蛋白的转录。[0008]将以上构建的四个融合蛋白与经Sal I和BamH I双酶切后的单拷贝质粒PRS41H共同转入酿酒酵母INVScl中，通过酿酒酵母自身的同源重组实现四个融合蛋白和质粒的连接，以质粒形式表达酶和蛋白支架共同组成的多酶复合体，构建的工程菌株为pRS41H_scaf。
[0009]本发明的酿酒酵母工程pRS41H-scaf，为在其中将强化表达的IDI，FPPS，SQS通过蛋白支架共区域化构建人工多酶复合体，来提高酿酒酵母鲨烯的生产能力。
[0010]本发明方法具有以下优点:
[0011]1、本发明通过蛋白支架的形式将鲨烯合成途径的关键酶共区域化，模拟天然的底物隧道效应，有效的减少传质阻力。
[0012]2、本发明通过将FPP与SQS共区域化一方面可以减少有毒中间代谢物FPP向周围的扩散，另一方面，也可以加速FPP向鲨烯的快速转化，减少FPP其对细胞的毒害作用。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】进一步详细描述。
[0014]实施例1:用连接器组合I构建融合蛋白工程菌
[0015]1、克隆经密码子优化的GBD，WHl，PDZ三个基因，通过OE-PCR用两段9个甘氨酸和丝氨酸交替排列组成的连接器将GBD，WH1，PDZ组成一个融合基因，然后与启动子FBAl和终止子FBAl同样通过OE- PCR连接成一个大的融合基因。
[0016]2、从 E.coli BL21 (DE3)中克隆 IDI,从 Saccharomyces cerevisiae INVSCl 中克隆FPPS和SQS，，将GBD，WHl和PDZ的配基分别通过9个甘氨酸和丝氨酸交替排列组成的连接器与IDI，FPPS和SQS的N端或C端融合，做成三个融合基因。用三个来源于酿酒酵母的启动子Nam2，Alai, Gpml和对应的终止子Nam2，Alai, Gpml分别启动和终止三个融合基因的转录。
[0017]3、将单拷贝质粒pRS41H用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切后，与上述融合基因混合，无水乙醇沉淀后用5yL无菌水溶解。电转化酿酒酵母的感受态细胞Saccharomyces cerevisiae INVSC1,转化成功的工程菌株在潮霉素B抗性平板上生长,菌落PCR筛选阳性酿酒酵母工程菌，进一步发酵培养验证。
[0018]实施例2:用连接器组合2构建融合蛋白工程菌
[0019]1、克隆经密码子优化的GBD，WHl，PDZ三个基因，通过OE-PCR用两段12个甘氨酸和丝氨酸交替排列组成的连接器将GBD，WH1，PDZ组成一个融合基因，然后与启动子Tys和终止子Tys同样通过OE-PCR连接成一个大的融合基因。
[0020]2、从 E.coli BL21 (DE3)中克隆 IDI,从 Saccharomyces cerevisiae INVSCl 中克隆FPPS和SQSJf GBD，WHl和PDZ的配基分别通过12个甘氨酸和丝氨酸交替排列组成的连接器与IDI，FPPS和SQS的N端或C端融合，做成三个融合基因。用同一个来源于酿酒酵母的启动子Tys和终止子Nam2，Alai, Gpml分别启动和终止三个融合基因的转录。
[0021]3、将单拷贝质粒pRS41H用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切后，与上述融合基因混合，无水乙醇沉淀后用5yL无菌水溶解。电转化酿酒酵母的感受态细胞Saccharomyces cerevisiae INVSC1,转化成功的工程菌株在潮霉素B抗性平板上生长,菌落PCR筛选阳性酿酒酵母工程菌，进一步发酵培养验证。[0022]实施例3:酿酒酵母工程菌发酵生产鲨烯[0023]挑选实施例1筛选出的酿酒酵母工程菌，在含有2%的葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母粉的培养基中30 °C摇瓶培养，取样时间点为8h，12h，16h，20h, 24h，36h，48h，60h, 72h，64h,96h, 108h, 120h。每次取样量为40mL,样品处理过程如下:5000rpm离心5min,沉淀用IOmL的20%氢氧化钾溶液(含有50%乙醇)重悬，然后在沸水中煮沸lOmin，室温冷却后用正己烧萃取2次,萃取液合并后浓缩至ImL,然后利用安装有Agilent色谱柱DB-1(30m*0.25mm*0.25um)的岛津气相色谱-进行酿酒酵母工程菌发酵生产鲨烯的分析。结果发现，酿酒酵母工程菌在发酵16h时鲨烯产量最大。
【权利要求】
1.一种提高酿酒酵母中鲨烯合成的方法，其特征在于，利用蛋白支架将外源表达于酿酒酵母中鲨烯合成途径的异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶和鲨烯合酶共区域化。
2.如权利要求1所述的提高酿酒酵母中鲨烯合成的方法，其特征在于，所述的鲨烯合成途径的三个酶来自E.coli, Saccharomyces cerevisiae或其他生物中具有相同或相似功能的酶。
3.如权利要求1所述的提高酿酒酵母中鲨烯合成的方法，其特征在于，所述的蛋白支架是起到能使酶共区域化作用的蛋白，包括通过成对的相互作用蛋白质和多肽连接器构建的蛋白支架，通过自组装蛋白质构建的蛋白支架和通过借助化学修饰蛋白构建的蛋白支架。
4.如权利要求3所述的蛋白质支架，来源于动物、植物或微生物中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的多肽连接器，由一种以上氨基酸组合构成，连接器长度处于5至20个氨 基酸之间。
【文档编号】C12N15/62GK103849643SQ201410088307
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】李春, 曹欠, 张根林 申请人:北京理工大学
文档序号 :
【 471527 】
技术研发人员：李春,曹欠,张根林
技术所有人：北京理工大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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