转化微生物、d-酰化氨基酸水解酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及将在D-酰化氨基酸水解酶及L-酰化氨基酸水解酶中，选择性生成D-酰化氨基酸水解酶的D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的微生物中形成的转化微生物，以及利用该转化微生物的D-酰化氨基酸水解酶制备方法。
背景技术：
高光学纯度的D-氨基酸是抗生物质的侧链和多肽类药物制备过程中所需的氨基酸，而D-酰化氨基酸水解酶是产业上用于制备D-氨基酸的酶。
目前，作为可同时生成D-酰化氨基酸水解酶和L-酰化氨基酸水解酶的微生物， 已知如化学和药学通报(Chemical andPharmaceutical Bulletinn)26，2698(1978)报道的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)AAA6029株；特开昭53-59092号公报报道的橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)S·62等放线菌。利用这些微生物时，姑且不论D-酰化氨基酸水解酶生成能力，由于同时可生成作为光学异构体的D-酰化氨基酸水解酶和L-酰化氨基酸水解酶，因此明显的缺点是分离两者需要烦琐且高成本的操作。
另一方面，作为选择性生成D-酰化氨基酸水解酶的微生物，已知如特开平1-5488号公报报道的反硝化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans)MI-4株。利用该菌种时，虽省却了分离D-酰化氨基酸水解酶和L-酰化氨基酸水解酶的麻烦，但D-酰化氨基酸水解酶的生成能力却显得不足。并且，由于在特开平1-5488号公报中并未阐明D-酰化氨基酸水解酶生成基因的碱基序列，因此无法改变基因以提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力和创建高生成性的转化微生物。
鉴于以上所述，本申请的发明人森口等阐明了木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes xylosoxydans subsp.xylosoxydans)A-6株具有的D-酰化氨基酸水解酶生成基因的结构，相关碱基序列示于序列表的序列号1中。进而，本发明人通过对该D-酰化氨基酸水解酶生成基因加以一定的改变，显著提高了转化微生物的D-酰化氨基酸水解酶生成能力(Protein Expression and Purification 7，395-399(1996))。
发明内容
随后的研究表明，导入上述D-酰化氨基酸水解酶生成基因的各种转化微生物在含锌离子的培养基中，可大大提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力。尤其是将锌离子浓度控制在一定范围时，生成能力得以显著提高。
再者，已知上述效果因宿主微生物的种类不同，其程度具有很大的差异。对于效果强的微生物，通常在转化前即可表现出锌耐受性。这种锌耐受性是指，以菌体量(A660nm)为繁殖能力测定指标时，添加锌离子难以抑制其繁殖能力。
基于上述认识，可指出以下①、②两个事项。即，①其原因虽不明确，但存在一定量的锌离子时，携有序列表序列号1所示D-酰化氨基酸水解酶生成基因的转化微生物的表达可得到增强。②由于锌离子对于通常的微生物具有抑制作用，因此为确保锌离子的效果，有必要将原本就具有锌耐受性的微生物作为基因导入的宿主。
基于以上观点，本发明提供用D-酰化氨基酸水解酶生成基因转化的微生物，通过向培养基中添加锌离子，该微生物的D-酰化氨基酸水解酶生成能力进一步大大增强。此外，本发明还提供利用上述转化微生物的D-酰化氨基酸水解酶制备方法。
本发明的转化微生物具有下列特征将因锌离子的存在而使基因产物的表达得以增强的D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的宿主微生物中，进而获得在含锌离子的培养基中的D-酰化氨基酸水解酶高表达性性状；该转化微生物是用D-酰化氨基酸水解酶生成基因进行转化的微生物，通过向培养基中添加锌离子，可最大限度地增强D-酰化氨基酸水解酶生成能力。
本发明的转化微生物中，更优选上述D-酰化氨基酸水解酶生成基因或具有序列表的序列号1所示的碱基序列，或者具有可与序列表的序列号1所示的碱基序列在严格条件下杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列。已知具有序列表的序列号1所示碱基序列的D-酰化氨基酸水解酶生成基因，在存在锌离子的条件下，可更为显著地增强基因产物的表达。因此，可与序列表的序列号1所示碱基序列在严格条件下杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列也有望具有同样的特征。
本发明的转化微生物中，更优选的宿主微生物为大肠杆菌。已知大肠杆菌具有锌耐受性。并且，对于大肠杆菌的菌体学性质、生理性质、培养条件和管理条件等也已熟知。因此，D-酰化氨基酸水解酶的高效生产可在相对容易的生产管理条件下进行。
本发明的转化微生物中，更优选对于导入宿主微生物的D-酰化氨基酸水解酶生成基因进行以下(1)和/或(2)的修饰。(1)在核糖体结合区域设计特定的碱基序列(GAAGGA)，并导入基因的翻译起始位点上游9个碱基的位置，进而提高翻译效率。通过这种修饰，可提高D-酰化氨基酸水解酶生成基因的翻译效率。(2)在基因的上游和下游设置大肠杆菌的Hind III识别位点，纯化该基因并酶切后连接于表达载体，进而提高基因的表达效率。通过这种修饰，可提高D-酰化氨基酸水解酶生成基因的表达效率。
可应用锌耐受性微生物作为以获得本发明转化微生物为目的的宿主微生物。更为具体地说，可应用以菌体量(A660nm)的增加或减少为指标测定培养基中的繁殖能力时，添加锌不会过于抑制其繁殖能力的微生物。作为锌耐受性的一个判断标准，例如相对于该微生物在未添加锌的培养基中的菌体量(A660nm)，添加2mM锌的同一条件培养基中的菌体量的增加或减少程度止于10％以内。或者，例如添加5mM锌的同一条件培养基中的菌体量的增加或减少程度止于20％以内。
对于宿主微生物的分类上的种类没有特殊的限制，一般来说，优选形态学性质和生理学性质均已熟知，且其培养条件和管理条件已知的宿主微生物。作为宿主微生物的优选例，例如大肠杆菌(Eschericiacoli)。相反，含有上述A-6株的木糖氧化产碱菌种的微生物与大肠杆菌相比，不具备锌耐受性。
对于D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入宿主微生物的方法没有特殊的限定，例如可根据情况任意选择连接质粒后导入的方法，及连接于噬菌体DNA后导入的方法等。
本发明的D-酰化氨基酸水解酶生成基因是在D-酰化氨基酸水解酶及L-酰化氨基酸水解酶中选择性生成D-酰化氨基酸水解酶的基因，该基因的表型为，培养基中存在锌离子时，其活性表达可进一步得到增强。作为已确定为该类型D-酰化氨基酸水解酶生成基因而优选的一个例子，例如具有序列表的序列号1所示碱基序列。或者，具有在严格条件下，可与序列表序列号1所示碱基序列杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列，但实际上其活性表达不能因培养基中存在锌离子而得以增强的除外。
具有序列表的序列号1所示碱基序列的D-酰化氨基酸水解酶生成基因由上述木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenesxylosoxydans subsp.xylosoxydans)A-6株获得。该A-6株是从自然界的土壤中筛选得到的D-酰化氨基酸水解酶生成菌。
本发明的D-酰化氨基酸水解酶的制备方法为，在含锌培养基中培养上述的任一转化微生物，并从该培养物获得D-酰化氨基酸水解酶。锌离子的供给，例如可通过向培养基中适量添加氯化锌、硫酸锌等锌化合物来实现。通过这种方法，可高效制备D-酰化氨基酸水解酶。
本发明的D-酰化氨基酸水解酶制备方法中，更优选将上述培养基中所含锌离子浓度控制在0.1～10mM。通过该方法，培养基中的锌离子浓度得以最优化，并可尤为高效地制备D-酰化氨基酸水解酶。
对于D-酰化氨基酸水解酶的制备方法中，除上述方法以外的实施方法和实施条件没有特殊的限制，但优选将tac启动子的诱导物(例如异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、乳糖等)作为诱导物，并在营养培养基中进行培养，更优选将培养时的乳糖浓度控制在0.1～1％程度。
附图的简单说明
图1为用于连接D-酰化氨基酸水解酶生成基因的质粒的概念化图。
图2为连接了D-酰化氨基酸水解酶生成基因的质粒的概念化图。
实施发明的最佳方案以下，对实施本发明的最佳方案和比较例进行说明，但本发明并不受限于这些实施方案。
(基因的获得和碱基序列的测定)用限制酶Sau 3AI部分酶解从木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种A-6株得到的染色体DNA，得到2～9Kb的DNA片断。将得到的DNA片断插入连接于已知的质粒pUC118的BamHI识别位点。用该连接质粒转化大肠杆菌JM109，得到氨苄青霉素抗性转化株。进而由通过上述方法得到的转化株得到具有选择性生成D～酰化氨基酸水解酶能力的菌株。具有这种能力的转化株携有含5.8Kb插入片断的质粒。
酶切上述质粒中5.8Kb的插入片断，以测定D-酰化氨基酸水解酶生成基因的位置。然后按常规方法，测定约2.0Kb DNA的碱基序列，测定出的碱基序列如序列表的序列号1所示。序列表中同时附有对应的氨基酸序列。其结果，可确认出由ATG起始的、由1452个核苷酸组成的开放阅读框架(Open Reading Frame；ORF)。
(基因的修饰)用BamHI-HindIII酶切携有上述5.8Kb插入片断的质粒，得到4Kb的DNA片断，将此片断与已知的质粒pUC118连接，进而构建连接质粒pAND118。以pAND118为模板，通过应用引物的定点诱变，制备对核糖体结合位点(Ribosome Binding Site；RBS)进行过修饰的质粒pANSD1。
随后，以pANSD1为模板，通过应用引物的定点诱变，分别在上述RBS的上游设置EcoRI的识别位点、在ORF的下游设置HindIII的识别位点，进而构建pANSD1HE。
其次，用限制酶EcoRI-HindIII酶切质粒pANSD1HE，得到1.8Kb的DNA片断。将该DNA片断插入连接于
图1所示质粒pKK223-3的EcoRI-HindIII位点，得到图2所示的质粒pKNSD2。
(转化大肠杆菌)以源自大肠杆菌(Eschericia coli)K12的菌株为宿主，按D.HANAHAN的方法(DNA cloning Vol.1109～136 1985)导入质粒DNA，得到转化大肠杆菌E.coli TG1/pKNSD2。
(基因获得源菌株的锌耐受性)在含0.2％磷酸二氢钾、0.2％磷酸氢二钾、2％聚胨、0.01％硫酸镁、1％甘油、pH7.2的未添加锌的培养基，及在与此同一组成的培养基中分别加入浓度为0.2mM、2.0mM、5.0mM氧化锌的添加锌的培养基中，30℃、24小时培养上述木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种A-6株。培养后，通过测定菌体量(A660nm)评价其锌耐受性。同时，测定培养后培养基的pH。其结果示于表1的“A-6菌”所示一栏中。
表1
由表1可知，相对于未添加锌的培养基中A-6株的菌体量，添加锌的培养基中A-6株的菌体量显著减少(添加2.0mM锌的培养基中减少约35％，添加5.0mM锌的培养基中减少约60％)，上述A-6株不具有锌耐受性。
(宿主菌的锌耐受性)对于作为宿主菌应用的源于上述大肠杆菌K12株的菌株，用与上述A-6株同一组成的培养基，同样地进行菌体量(A660nm)的测定，并对其锌耐受性进行评价。其结果示于表1的“TG1(宿主菌)”所示一栏中。
由表1可知，相对于未添加锌的培养基中宿主菌的菌体量，添加锌的培养基中宿主菌的菌体量没有过多减少(添加2.0mM锌的培养基中减少约3％，添加5.0mM锌的培养基中减少约12％；而添加0.2mM锌的培养基中菌体量却有所增加)，上述宿主菌具有锌耐受性。
(转化大肠杆菌的锌耐受性)对于转化大肠杆菌E.coli TG1/pKNSD2，用与上述A-6株同一组成的培养基，同样地进行菌体量(A660nm)的测定，并对其锌耐受性进行评价。其结果示于表1的“pKNSD2/TG1(重组菌)”所示一栏中。
由表1可知，相对于未添加锌的培养基中转化大肠杆菌的菌体量，添加锌的培养基中转化大肠杆菌的菌体量没有过多减少(添加2.0mM锌的培养基中减少约5％，添加5.0mM锌的培养基中减少约15％；而添加0.2mM锌的培养基中菌体量却有所增加)，上述转化大肠杆菌具有锌耐受性。
(对于转化大肠杆菌的锌添加效果)在含1％细菌用胰化蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、0.5％氯化钠、100μg/ml氨苄青霉素、pH7.0的培养基中，30℃、16小时预培养转化大肠杆菌E.coli TG1/pKNSD2。
随后，在含0.2％磷酸二氢钾、0.2％磷酸氢二钾、2％聚胨、0.01％硫酸镁、1％甘油、作为诱导物的0.1％乳糖、pH7.0的未添加锌的培养基，及在与此同一组成的培养基中分别加入浓度为0.2mM、2.0mM氧化锌的添加锌的培养基中，30℃、24小时培养预培养后的转化大肠杆菌。并且，测定培养后培养液的pH(Broth-out pH)和培养液(A660nm)中D-酰化氨基酸水解酶活性(U/mL)。
其结果，相对于未添加锌的培养基中的酶活性为21.78U/mL(Broth-out pH5.05)，添加0.2mM锌的培养基中的酶活性为58.85U/mL(Broth-out pH5.03)，添加2.0mM锌的培养基中的酶活性为109.79U/mL(Broth-out pH5.11)。因此可确认，通过添加至少处于一定浓度范围的锌离子，可显著提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力。
作为比较，用上述预培养用培养基(但未加入氨苄青霉素)在相同的条件下预培养上述A-6株，随后，除了诱导物用0.1％N-乙酰基-D，L-亮氨酸代替上述0.1％乳糖之外，在其余组成与上述培养用培养基相同的培养基中，用与以上述相同的条件进行培养。并且，测定培养后培养液的pH和培养液(A660nm)中D-酰化氨基酸水解酶活性(U/mL)。
其结果，相对于未添加锌的培养基中的酶活性为0.29U/mL(Broth-out pH7.47)，添加0.2mM锌的培养基中的酶活性为0.12U/mL(Broth-out pH7.48)，添加2.0mM锌的培养基中的酶活性为0.29U/mL(Broth-out pH7.43)。因此可确认，通过添加锌离子，获得了提高D-酰化氨基酸水解酶的生成能力的效果。
产业上的实用性如上所述，通过应用本发明的转化微生物，可有选择性地、且高效地生成产业上有用的D-酰化氨基酸水解酶。
序列表<110>天野酶株式会社(Amano Enzyme Inc.)<120>转化微生物、D-酰化氨基酸水解酶的制备方法<130>IPOK-00-010WO<160>1<210>1<211>1758<212>DNA<213>木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes xylosoxydans subsp. Xylosoxydans)<400>1gaattccact tgatcgcgga aggagagatt tcc atg tcc caa tcc gat tcc cag ccc 57Met Ser Gln Ser Asp Ser Gln Pro1 5ttc gac ctg ctg ctc gcg ggc ggc acc ctc atc gac ggc agc aac acc 105Phe Asp Leu Leu Leu Ala Gly Gly Thr Leu Ile Asp Gly Ser Asn Thr10 15 20ccg ggg cgg cgc gcc gac ctg ggc gtg cgc ggc gac cgc atc gcc gcc 153Pro Gly Arg Arg Ala Asp Leu Gly Val Arg Gly Asp Arg Ile Ala Ala25 30 35 40atc ggc gat ctg tcg gac gcc gcc gcg cac acc cgg gtc gac gtg tcg 201Ile Gly Asp Leu Ser Asp Ala Ala Ala His Thr Arg Val Asp Val Ser45 50 55
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权利要求
1.一种转化微生物，其特征在于，将因锌离子的存在而使基因产物的表达得以增强的D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的宿主微生物中，进而获得在含锌离子的培养基中的D-酰化氨基酸水解酶高表达性性状。
2.根据权利要求1所述的转化微生物，其中，上述D-酰化氨基酸水解酶生成基因或者具有序列表序列号1所示的碱基序列，或者具有在严格条件下可与序列表序列号1所示的碱基序列杂交的同时，有效地编码D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列。
3.D-酰化氨基酸水解酶的制备方法，其特征在于，将因锌离子的存在而使基因产物的表达得以增强的D-酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的宿主微生物中，由此获得的转化微生物在含锌离子的培养基中进行培养，进而从培养物中获得D-酰化氨基酸水解酶。
4.根据权利要求3所述的D-酰化氨基酸水解酶的制备方法，其中，将上述培养基中所含锌离子浓度控制在0.1～10mM。
全文摘要
将在D－酰化氨基酸水解酶及L－酰化氨基酸水解酶中，选择性生成D－酰化氨基酸水解酶的D－酰化氨基酸水解酶生成基因导入具有锌耐受性的微生物中，进而获得转化微生物。将该转化微生物在含锌离子的培养基中进行培养，并从培养物中高效率地获得D－酰化氨基酸水解酶的方法。
文档编号C12N9/78GK1514876SQ00811610
公开日2004年7月21日 申请日期2000年6月15日 优先权日1999年6月17日
发明者竹内贤一, 小出芳直, 广濑芳彦, 森口充瞭, 矶部公安, , 安, 彦, 直 申请人:天野酶株式会社
文档序号 :
【 565118 】
技术研发人员：竹内贤一,小出芳直,广濑芳彦,森口充瞭,矶部公安
技术所有人：天野酶株式会社
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：竹内贤一,小出芳直,广濑芳彦,森口充瞭,矶部公安
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