一种t-2毒素的酵母菌发酵去除方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法。
【背景技术】
[0002]T-2毒素属于真菌毒素，是毒性最强的单端孢霉烯族毒素，是由产毒真菌在适宜的 环境条件下产生的有毒代谢产物，经常污染食品（特别是粮食制品）和饲料，对人类和动物 具有多种毒害作用，国内外对粮谷、食品和饲料中的T-2毒素制定了严格的限量标准。
[0003] 酵母菌可以去除某些真菌毒素，最早研宄酵母菌去除真菌毒素是Ciegler等 (1966)、Mann等（1977)，他们研宄了酵母菌对黄曲霉毒素脱毒作用。Scott等（1995)、 Torres等（2001)报道了啤酒和蒸馏酒生产中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A的消长规律。Scott 等（1996)报道含有酵母菌细胞壁的酒糟能将黄曲霉毒素吸附。上述酿酒酵母使家禽动物 具有抗黄曲霉毒素的能力（Devegowda等，1998 ;Stanley等，1993)。Santin等（2003)报道 了酵母菌细胞壁作为家禽动物的饲料添加剂，能降低黄曲霉毒素的毒效应。到目前为止，研 宄最多是利用酵母菌对黄曲霉毒素进行脱毒，但尚没有没有报道酵母菌对T-2毒素具有去 除作用，更没有摸索其可以工业化应用的条件。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法。
[0005] 一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
[0006] (1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为 IXIO8-IX109CFU/mL;
[0007] (2)向含有T-2毒素的污染粮食中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为污染粮食质量的 1% ；
[0008] (3)常温发酵3-6天，将被污染粮食取出，晒干。
[0009] 所述酵母菌菌种为食品发酵级菌种Saccharomycescerevisiae1221。
[0010] 所述粮食为小麦、大麦、玉米、高粱、稻谷。
[0011] 所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株接种于YPD(Yeast ExtractPeptoneDextrosemedium，YPD)平板，于30°C培养箱中有氧培养48h，挑起单菌 落接入YH)液体培养基中，于30 °C培养箱中150r/min有氧振荡培养48h，再按1 %接种量接 种于YH)液体培养基中，30°C培养箱中150r/min有氧振荡培养30-60h，在到达稳定生长期 时，活菌数为IXIO8-IXIO9CFUAiL时，取出培养液。
[0012] 所述常温发酵温度为20°C-30°C。
[0013] 本发明的有益效果：本发明的方法可以有效的去除被污染粮食和饲料中的T-2毒 素，操作方法简单，去除率高，可应用于粮食和饲料中T-2毒素的脱毒，以使其达到国家标 准。
【附图说明】
[0014] 图1为酵母菌的生长曲线。
[0015] 图2为T-2毒素的多反应监测（MRM)色谱图截图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0017] 实施例1酵母菌发酵对T-2毒素去除作用实验
[0018] 酵母菌培养基YPD培养基，购于德国SERVAElectrophoresisGmbH公司，称取50g 于1000 mL超纯水中，用玻璃棒搅拌至完全溶解，分装至三角瓶，121°C高压灭菌20min，制成 YH)液体培养基，4°C保存。灭菌前在其中添加1. 5 %的琼脂，灭菌后倒平板，制成YH)平板， 4°C保存。
[0019] 毒素标准储备液制备：精确称取购于美国Sigma-Aldrich公司的T-2毒素标准品 5.Omg于5mL容量瓶中，用乙腈溶解、定容，制成I.Omg/mLT-2毒素准储备液，于-20°C条件 下避光保存，使用前拿出置于室温条件下30min，每次使用不超过lh，每月更新。
[0020] 毒素标准工作液制备：将T-2毒素标准储备液用5 %甲醇水溶液（初始流动 相）、YPD液体培养基、PBS缓冲液稀释、定容，制成100. 0yg/mL、10. 0yg/mL、I. 0yg/mL、 0. Iyg/mL、0. 01yg/mL的毒素标准工作液、YPD液体培养基基质标准工作液、PBS缓冲液基 质标准工作液，于4°C条件下避光保存，使用前拿出置于室温条件下30min，每次使用不超 过2h，每10天更新。
[0021] 酵母菌菌株为食品发酵常用的食品级酵母菌菌株Saccharomycescerevisiae 1221。
[0022] 酵母菌菌种的活化：将保存的酵母菌菌株接种于Yro平板，于30°C培养箱中有氧 培养48h，挑起单菌落接入Yro液体培养基中，于30°C培养箱中有氧振荡培养（振荡频率 150r/min) 48h，再按1 %接种量接种于YH)液体培养基中，30°C培养箱中有氧振荡培养（振 荡频率150r/min)48h，置于冰箱4°C保存。将活化后的酵母菌培养液按1%接种量接种于 IOOmLYH)液体培养基中，30°C有氧振荡培养（振荡频率150r/min)，于0h、6h、12h、18h、 24h、30h、36h、42h和48h取出，在波长680nm处，测定培养液吸光度值（0D值），测定时以未 接种YH)液体培养基为空白对照。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制酵母菌生长曲线 (如图1所示）。根据酵母菌生长曲线，在到达稳定生长期时，取出培养液稀释后，用YPD平 板计数。活菌数大约为108CFU/mL。
[0023] 酵母菌发酵对T-2毒素的去除作用实验：将活化后的酵母菌发酵液按1 %接种量 接种到添加T-2浓度为I. 0yg/mL的YH)培养基中，30°C有氧振荡（振荡频率150r/min)培 养，011、2411、4811、7211、9611分别取出测定1'-2毒素。通过高效液相色谱-串联质谱法对1'-2 毒素的去除效果进行测定。
[0024] 所述高效液相色谱-串联质谱法的色谱条件：采用日本ShimadzuUFLCLC-20AD 高效液相色谱系统，其中LC分离柱为日本ShimadzuShim-peakUP-〇DS(150_X4.6_ 1.d.，3.0ymp.s)，LC保护柱为日本ShimadzuShim-peakGPRC_0DS(8mmX1.5mmi.d.， 5.0ymp.s.)。流动相：A(水，含5mmol/L醋酸铵和0.2%甲酸）；B(甲醇）。梯度洗脱： 0 ~2min，5%B;2 ~5min，5%~95%B;5 ~10. 5min，95%B;10. 5 ~llmin，95%~5% B。流速：0? 3mL/min。柱温：40°C。进样量：30yL。
[0025] 所述高效液相色谱-串联质谱法的质谱条件：采用美国AppliedBiosystems SciexAPI4000triplequadrupoleinstrumentequippedwithIonSourceTurbo Spray串联质谱系统，其中扫描方式：正离子模式扫描（Positive)。检测模式：多反应检测 (MRM)。气帘气压力（CUR) :40psi(氮气）。离子源气体I(GASl) :60psi(氮气）。离子源气 体2(GAS2) :60psi(氮气）。离子源温度（TEM) :650°C。界面加热器（IHE) :0N。电喷雾电 压（IS) :5500.00V。碰撞气压力（CAD) :10psi(氮气）。条件如表1所示。
[0026] 表IT-2毒素的跃迀监测及电喷雾离子源条件
[0027]
【主权项】
1. 一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，按照如下步骤进行： (1) 酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为 I X IO8-I X 109CFU/mL ; (2) 向含有T-2毒素的污染粮食中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为污染粮食质量的1% ; (3) 常温发酵3-6天，将被污染粮食取出，晒干。
2. 根据权利要求1所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述酵母菌 菌种为食品发酵级菌种Saccharomyces cerevisiae 1221。
3. 根据权利要求2所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述粮食为 小麦、大麦、玉米、高粱、稻谷。
4. 根据权利要求1所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述酵母 菌培养液的制备方法为：将保存的酵母菌菌株接种于YH)平板，于30°C培养箱中有氧培养 48h，挑起单菌落接入YH)液体培养基中，于30°C培养箱中150r/min有氧振荡培养48h，再 按1%接种量接种于YH)液体培养基中，30°C培养箱中150r/min有氧振荡培养30-60h，在 到达稳定生长期时，活菌数为I X IO8-I X 109CFU/mL时，取出培养液。
5. 根据权利要求1所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述常温发 酵温度为20°C -30°C。
【专利摘要】本发明公开了属于生物化学技术领域的一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法。该方法首先通过酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，然后向含有T-2毒素的污染粮食中喷洒酵母菌培养液，常温发酵3-6天，将被污染粮食取出，晒干。本发明的方法可以有效的去除被污染粮食或饲料中的T-2毒素，操作方法简单，去除率高，可应用于粮食或饲料中T-2毒素的脱毒，以使其达到国家标准。
【IPC分类】A23L1-015
【公开号】CN104799132
【申请号】CN201510214195
【发明人】邹忠义
【申请人】邹忠义
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月30日
文档序号 :
【 8477682 】
技术研发人员：邹忠义
技术所有人：邹忠义
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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