用于mRNA扩增的改进的裂解和逆转录的制作方法

2025-07-12 11:00:07 160次浏览

专利名称：用于mRNA扩增的改进的裂解和逆转录的制作方法
技术领域：
本发明提供了通过进行RT-PCR而监测基因表达的新方法。更精确地，本发明公开了在培养贴壁细胞的小瓶中裂解贴壁细胞，并且随后在同一小瓶中将裂解物中包含的RNA 转录为单链cDNA的可能性。现有
背景技术：
群体中的细胞在很多方面的特征是独特的，甚至在看起来均质的培养物或组织中也是如此。基因表达水平显示很大的细胞与细胞之间的变异，这是由于各种因素的外部(外在) 和内部(内在)来源。同样，当暴露于相同刺激时，细胞通常随机表现。这表示获自细胞群的数据不能假定反映单个细胞的行为。已经提示细胞可以通过转录活性爆发反应于刺激并作为二元转换而运转；这是以全或无的方式。通常，通过多步程序，在常规基础上监测RNA水平上的基因表达。首先，从培养容器取出各自的细胞样品。在贴壁细胞的情况下，可以通过胰蛋白酶消化(用胰蛋白酶-EDTA 溶液处理)支持收获，从而使贴壁细胞从固相支持体脱离。其次，沉淀收集的细胞，并且进行细胞裂解。作为第三步，通常需要至少部分纯化存在于样品中的RNA或mRNA(EP 0 389 063)。此后，用 RNA 依赖性 DNA 聚合酶如 AMV(Roche Applied Science 目录号 11 495 062) 或MMuLV (Roche 11 062 603)逆转录酶进行第一链cDNA合成步骤。随后，通过定量 PCR(Sagner, G. , and Goldstein, C. , BIOCHEMICA 3 (2001) 15-17)，或者，通过扩增和随后杂交到DNA微阵列上(Kawasaki, Ε. S.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 1020 (2004) 92-100)，对产生的cDNA的量进行定量。在PCR的情况下，可以进行一步RT-PCR，特征在于通过相同的聚合酶如T. th聚合酶(Roche Applied Science目录号11 480 014)催化第一链cDNA合成和随后的扩增。在传统的实时RT-PCR或qRT-PCR中，首先在耗时的程序中从细胞分离RNA，这会导致材料的损失。使用CellsDirect cDNA合成系统(Invitrogen目录号11737-030)，在单个试管中以最少的操作裂解细胞并且从裂解物产生cDNA并且没有样品损失。在第一链合成前加入DNA酶I，以消除基因组DNA。合成后，第一链cDNA可以直接转移到qPCR反应中而没有中间有机萃取或乙醇沉淀。针对从10，000个细胞低至单个细胞的小的细胞样品优化了该试剂盒。相似的流程公开于(W0 08/135197)。在上下文中，本发明的根本技术问题是提供高通量方法和试剂盒，其允许进一步简化的基因表达监测分析流程。简沭
因此，本发明涉及进行用于扩增靶RNA的RT-PCR的方法，该方法包括以下步骤
a)在细胞培养容器中培养贴壁细胞群，
b)在所述样品容器中用包含0.05M-I M离液剂的裂解缓冲液裂解推测含有所述靶 RNA的所述贴壁细胞群，
c)在所述样品容器中加入进行逆转录反应所必需的试剂，使得所述离液剂在所述样品容器中以约10-60 mM的浓度存在，并且将所述靶RNA逆转录为第一链cDNA，d)通过进行多个循环的热循环流程，扩增所述第一链cDNA。在一个主要的实施方案中，实时监测扩增步骤。优选地，离液剂是硫氰酸胍。同样优选地，裂解缓冲液包含约0. 2-0. 5 M的离液剂。在本发明方法的步骤c)中，离液剂以约30-50 mM，优选约40 mM的浓度存在。同样优选地，该新方法的步骤b)在非离子型去污剂的存在下进行，所述去污剂例如可以是NP40。在步骤c)中，所述非离子型去污剂具有0. 1-2%的V/V。同样优选地，步骤a)包含加入碳水化合物，其可以是糖或葡聚糖。在一个特定实施方案中，在步骤b)和C)之间或在步骤c中加入DNA酶。优选地，所述DNA酶主要是双链特异性DNA酶，并且优选是DNA酶I或虾核酸酶(Shrimp Nuclease)。在另一特定实施方案中(其不与上文公开的实施方案互相排他)，在步骤b)中或在步骤c)之前加入蛋白酶K。第二方面，本发明也提供了试剂盒，其包含
-用于培养至少一个细胞样品的一次性容器(disposable)， -裂解缓冲液，和
-包含逆转录酶活性的DNA聚合酶。此外，所述试剂盒可进一步包含至少一种另外的组分，所述组分选自非离子型去污剂、碳水化合物、DNA酶和蛋白酶。附图简述
所有图包括代表qPCR扩增曲线的上图和代表解链曲线分析的下图。存在于更左侧位置的扩增曲线对应于重复测量值，而更右侧的扩增曲线对应于未加入Transscriptor酶的对照。右侧的解链峰对应于重复样品的特定扩增产物，而更左侧的解链峰对应于不含 Transcriptor酶的对照中的引物二聚体形成。

图1如实施例1所具体描述的本发明的小鼠星形胶质细胞中ACTB表达的qPCR和解链曲线分析(1:1样品稀释)
图2如实施例1所具体描述的本发明的小鼠星形胶质细胞中ACTB表达的qPCR和解链曲线分析(1:4样品稀释)
图3如实施例1所具体描述的本发明的小鼠星形胶质细胞中TUBB5表达的qPCR和解链曲线分析(1:1稀释)
图4如实施例1所具体描述的本发明的HeLA细胞中ACTB表达的qPCR和解链曲线分析(1:1稀释) 详述
根据本发明，可以在特定培养容器中进行贴壁真核细胞或甚至原核细胞的裂解，并且在同一培养容器中进行逆转录反应，从而制备单链cDNA。因此，本发明更精确地涉及进行用于扩增靶RNA的RT-PCR的方法，该方法包括以下步骤
a)在细胞培养容器中培养贴壁细胞群，
b)在所述样品容器中用包含0.05M-I M离液剂的裂解缓冲液裂解推测含有所述靶 RNA的所述贴壁细胞群，c)在所述样品容器中加入进行逆转录反应所必需的试剂，使得所述离液剂在所述样品容器中以约10-60 mM的浓度存在，并且将所述靶RNA逆转录为第一链cDNA，
d)通过进行多个循环的热循环流程，扩增所述第一链cDNA。因此，细胞培养、裂解和逆转录反应，S卩，步骤a) - c)，都在同一容器中进行。因此，并且与大多数现有技术的方法相反，在进行逆转录反应前不需要纯化裂解物。也就是说，步骤c)紧接着步骤b)，无需任何中间的纯化步骤。步骤a)，S卩，在细胞培养容器中培养贴壁细胞群，定义为在确定的时间段中使所述贴壁细胞群在合适的培养条件下生长，使得细胞具有分裂可能性并且活细胞的总数增加到至少2倍的步骤。此外，重要的是注意本领域使用的流程需要胰蛋白酶消化步骤，这表示为了使贴壁细胞从固相支持体分离，用含有可商购的胰蛋白酶-EDTA (例如^witrogen目录号 25200 056，Genaxxon目录号4260. 0500)的合适缓冲液温育细胞培养物。相反，本发明不需要通过胰蛋白酶使细胞从固相支持体分离，因为细胞直接在原位裂解。根据步骤d)的扩增通常以使用特异性扩增引物对的PCR反应的形式进行，所述引物对设计为允许检测特异性cDNA种类。本发明的方法可以用于多种不同的定性和定量应用。原则上，任何类型的RNA都可以被转录和扩增。最重要地，本发明的方法适用于以定性和定量方式扩增和检测mRNA。因此，本发明特别适用于监测基因表达。为了控制收获、细胞裂解和逆转录的过程，可以将对照RNA掺入样品。对照RNA优选是人工RNA，其在逆转录步骤中转录为能够与样品中的RNA区分开的cDNA。在使用用于逆转录步骤的特异性引物的情况下，人工RNA可以来源于基因工程DNA模板的体外转录，所述模板包含插入，或仅部分代表应该要分析的靶序列。生物样品优选由贴壁真核细胞组成，S卩，通过附着于作为培养容器的部分的固相支持体而培养所述细胞并使其生长。对于本发明的方法，可以使用任何类型的培养容器。实例(但是其不限制本发明的范围)是培养皿和培养瓶，其具有适于作为用于贴壁细胞生长的固相支持体的内表面。这些类型的培养瓶使得能够大量制备特定类型的cDNA。其它实例是6孔、M孔、96孔、384孔或1536孔形式的微量滴定板，因为它们是本领域常用的。在本发明的方法在所述微量滴定板中进行的情况下，可以平行培养、裂解和逆转录多个样品。更精确地，在同一反应容器中进行细胞培养、细胞裂解、稀释、任何添加剂的加入和逆转录酶反应。因此，本发明的方法对于自动化过程中多个贴壁细胞样品的高通量分析特别有用。如果反应容器根据本领域建立的标准以M、96、384或1536孔微量滴定板的形式排列在一起，可以通过液体操作自动仪器将裂解试剂、各种添加剂和进行逆转录酶反应所必需的试剂加入样品中。因此，在一个特定方面，本发明涉及进行用于平行扩增至少一个靶RNA的多个 RT-PCR反应的方法，该方法包括以下步骤
a)在微量滴定板的分开的孔中培养多个贴壁细胞群，
b)在所述微量滴定板的所述孔中用包含0.05 M-I M离液剂的裂解缓冲液裂解推测含有所述靶RNA的所述多个贴壁细胞群，从而产生多个样品，
c)在所述孔中的所述多个样品中的每个样品中加入进行逆转录反应所必需的所有试剂，使得所述离液剂在所述微量滴定板的所述孔中以约10-60 mM的浓度存在，并且将存在于每个样品中的所述靶RNA逆转录为第一链cDNA，
d)通过进行多个循环的热循环流程，扩增每个样品中包含的所述第一链cDNA。在本发明的范围内，优选可以平行处理6、M、96、384或甚至1536个群体。同样，根据步骤d)的扩增通常以使用特异性扩增引物对的PCR反应的形式进行，设计所述引物对，使得能够检测特异性cDNA种类。在一个实施方案中，所述大量的多个孔可以含有源自不同细胞系或相同细胞系的不同细胞群，所述细胞群已经在不同条件下进行了预处理。在这种情况下，用相同的扩增引物对进行多个PCR扩增，从而研究不同条件下特定基因的表达。或者，大部分孔可以含有源自相同来源的相同类型的细胞群。在这种情况下，可以选择多个不同的扩增引物对，从而平行研究很多个不同基因的表达。但是，本领域技术人员可以理解，公开的这两种方法都不是互相排他的，并且，依赖于要分析的科学问题，本领域技术人员能够用合适数目的不同细胞类型和合适数目的不同PCR引物对设计阵列设置，从而实现各个微量滴定板中存在的全部数目的孔的最佳使用。此外，甚至可以通过多路PCR改进所述平行分析的潜能，所述多路PCR的特征在于用于扩增不同cDNA种类的多个引物对被用于相同的样品。特别是，这样的设置对于相对 RT-PCR定量实验是有利的，所述相对RT-PCR定量实验特征在于特定基因的表达相对于所谓的管家基因(其以相同水平组成型表达)的表达进行监测。所述管家基因的突出实例是 PBDG, GAPDH 和 ACTB 以及 18S 和 26S RNA 基因。根据本发明，通过直接加入裂解缓冲液实现贴壁细胞的裂解，而细胞仍然附着于固相支持体表面。这仅仅在裂解缓冲液包含离液剂时是可能的。根据本领域通常的理解，离液剂是破坏大分子如蛋白、DNA或RNA中的三维结构并使其变性的物质。离液剂干扰由非共价力，如氢键、范德华力和疏水作用介导的分子内相互作用的稳定化。离液剂包括但不限于脲、一些锂盐如高氯酸锂和胍盐，如氯化胍。在本发明的上下文中，特别优选的试剂是硫氰酸胍。为了能够直接在裂解物内进行逆转录酶反应而不采用任何中间纯化步骤，需要仅仅使用有限量的所述离液剂来裂解细胞样品，使得在步骤b)中，逆转录酶的活性不会受到可察觉的影响。因此，在步骤b )中加入的裂解缓冲液优选包含约0.2 - 0.5 M的离液剂。此外，在步骤c)开始时加入另外的试剂后，离液剂以约30 - 50 mM，优选约40 mM的浓度存在。在一个实施方案中，本发明的步骤b)在非离子型去污剂如NP40的存在下进行。或者，如果需要处理仅具有小体积的样品，步骤b)包括加入PCR相容的湿润剂，其导致有效避免蒸发效应。优选地，在本发明的上下文中，碳水化合物如糖或葡聚糖可以用作湿润剂。如果加入了 NP40或另一种非离子型去污剂，则应该选择去污剂的量，选择的方式使得在步骤 c)中，所述去污剂以0. 1 - 2%的V/V量存在。可以在多种温度下进行根据本发明的细胞收获和裂解。本发明方法的步骤b)通常进行至少5分钟，即，在16°C 进行。在这些情况下裂解所需的最长时间是大约30 分钟。类似地，甚至是在低于环境温度但高于5°C的温度下，步骤b)可以进行至少10分钟。在这些情况下裂解所需的最长时间是大约60分钟。如果处理非常小体积的样品，这些条件对于避免任何蒸发效应是非常有利的。它也消除了对加热的需要。
但是，为了加速和改进培养的贴壁细胞的裂解，裂解缓冲液可以补充蛋白酶K。在这种情况下，在浓度为约0.05 - 5 mg/ml，优选0. 1-1 mg/ml的蛋白酶K的存在下，在约 550C - 85°C的温度下，步骤b)进行至少5分钟。任选地，可以通过随后在约80°C - 90°C 的温度下，在步骤b)和步骤c)之间或步骤c)和步骤d)之间温育至少5分钟，通常不超过 30分钟，将所述蛋白酶K不可逆地灭活。根据本发明，在同一反应容器中进行细胞裂解和逆转录，已经证明了如果裂解的细胞中含有的基因组DNA可以被选择性除去同时细胞RNA保持完整，则这是高度有利的。实现这种效果的最有效的可能性是通过引入DNA酶消化步骤而酶促除去。因此，在本发明的一个主要实施方案中，在双链特异性DNA酶存在下进行步骤b)。优选地，这样的DNA酶是专门的双链特异性DNA如DNA酶I (Roche Applied Science目录号04 716 728)或虾DNA 酶(US 6，541, 204)，其浓度为每50 μ 反应物约0. 1单位(USB，目录号73814)。但是，由于在步骤d)中单链cDNA进一步进行DNA聚合酶催化的扩增反应，如PCR反应，在扩增反应前灭活所述DNA酶是高度有利的。因此，为了灭活DNA酶活性，在特定实施方案中，在约 80°C-90°的温度下，在步骤b)和步骤c)之间或步骤c)和步骤d)之间，将样品温育至少 5分钟，但不超过60分钟。或者，如果DNA酶是虾DNA酶，在步骤d)中PCR反应的第一个循环中的变性通常是足够的。对于第一链cDNA合成，使用具有反义序列的引物。这些引物是特异性引物，即结合mRNA的聚腺苷酸尾的寡-dT引物，或随机引物，如随机六聚体引物。对于后续PCR，将有义方向的序列特异性引物用作正向引物。反向引物是可以与第一链cDNA合成反应中使用的特异性引物相同的特异性引物。或者，反向引物与位于已经用于逆转录酶反应的引物的结合侧上游的序列杂交。本发明可适用于进行序列的一步RT-PCR，所述序列可行地具有最多5 kb的任何扩增子大小。本发明特别可用于进行2步RT 0 ，8卩，在第一反应中，将1 嫩逆转录为单链(^嫩。可以用于该步骤的RNA依赖性DNA聚合酶的实例是AMV逆转录酶(Roche Applied Science 目录号 11 495 062) ,MMuLV 逆转录酶(Roche Applied Science 目录号 Oil 062 603)和重组 iTranscriptor 逆转录酶(Roche Applied Science 目录号 03 531 317)。随后，加入通过PCR扩增所产生的单链cDNA所需的所有试剂，例如耐热DNA依赖性DNA聚合酶以及靶特异性正向和反向扩增引物。本发明的方法也可以用于进行1步PCR，特征在于在逆转录之前，在步骤C) 中加入RT-PCR必需的所有试剂和酶。例如，生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的 DNA 聚合酶能够进行 1 步 PCR(Roche Applied Science 目录号 12016338001)。或者，用酶混合物进行本发明的一步RT-PCR方法，所述酶混合物包含能够进行PCR反应的DNA模板依赖性的耐热DNA聚合酶和能够进行一步RT-PCR反应的逆转录酶步骤的RNA模板依赖性的DNA聚合酶，如AMV逆转录酶。但是，通常，用于培养贴壁细胞的大多数细胞培养容器的材料不是耐热的，并且各自的小瓶不能适合热循环仪。因此，对于1步RT-PCR方案，在逆转录步骤后，将产生的第一链cDNA的样品从培养容器转移到可以与热循环仪设备结合使用的反应容器中，而不需要中间加入另外的试剂。然而，如果用于培养所述贴壁细胞的细胞培养容器的材料是耐热的，则步骤d)也可以在所述容器中进行。特别是，如果细胞培养容器是以微量滴定板形式安排，则所述微量滴定板可以直接转移到配置用于取走所述板的热循环仪设备中。在一个主要实施方案中，实时监测扩增步骤。所述实时监测的特征在于所述一步 RT-PCR反应的过程是实时监测的。不同的检测形式是本领域已知的。已经证明了下面提到的检测形式对于RT - PCR有用，因此提供了基因表达分析的容易和直接的可能性。a) TaqMan水解探针形式
用两种组分标记单链杂交探针。当用合适波长的光激发第一组分时，根据荧光共振能量转移的原理，将吸收的能量转移到第二组分，即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤中，杂交探针与靶DNA结合，并且在随后的延伸阶段中通过Taq聚合酶的5’_3’核酸外切酶活性降解。结果，激发的荧光组分和猝灭剂在空间上彼此分开，因此可以测量第一组分的荧光发射。TaqMan探针测定详细公开于US 5, 210, 015, US 5，538，848和US 5，487，972中。 TaqMan杂交探针和试剂混合物公开于US 5，804, 375中。b)分子信标
这些杂交探针也用第一组分和猝灭剂标记，标记优选位于探针的两端。由于探针的二级结构，两种组分在溶液中空间上邻近。在与靶核酸杂交后，两种组分彼此分开，使得在用合适波长的光激发后，可以测量第一组分的荧光发射(US 5，118，801)。c) FRET 杂交探针
FRET杂交探针测试形式对于所有类型的均相杂交测定特别有用(Matthews，J. Α., and Kricka, L. J.，Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25)。其特征在于同时使用并且与扩增的靶核酸的同一链的相邻位点互补的两个单链杂交探针。用不同的荧光组分标记这两个探针。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移的原理，第一组分将吸收的能量转移到第二组分，使得当这两个杂交探针与要检测的靶分子的相邻位置结合时能够测量第二组分的荧光发射。作为监测FRET受体组分的荧光增加的替代，也可以监测作为杂交事件的定量测量值的FRET供体组分的荧光减少。特别是，FRET杂交探针形式可以用于实时PCR中，从而检测扩增的靶DNA。实时 PCR领域已知的所有检测形式中，已经证明了 FRET-杂交探针形式是高度灵敏、准确和可靠的(W0 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。作为使用两个FRET杂交探针的替代，也可以使用荧光标记的引物和仅仅一个标记的寡核苷酸探针(Bernard，P. S., et al., Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107)。在这一点上，它可以任意选择，无论引物是用FRET供体还是用FRET受体化合物标记。d) SybrGreen 形式
在用双链核酸结合部分检测扩增产物的情况下，如果在本发明的添加剂存在下进行实时PCR，这也在本发明的范围内。例如，也可以通过荧光DNA结合染料根据本发明检测各自的扩增产物，所述染料在用合适波长的光激发后一旦与双链核酸相互作用就发射相应的荧光信号。已经证明染料SybrGreenI和SybrGold (Molecular Probes)特别适于本申请。可以替代地使用嵌入染料。但是，对于这种形式，为了区分不同的扩增产物，必须进行各自的解链曲线分析(US 6，174,670)。根据本发明的试剂念
另一方面，本发明也提供了试剂盒，其包含(i)用于培养至少一个细胞样品的一次性容器，
( )裂解缓冲液，和
(iii)包含逆转录酶活性的DNA聚合酶。一次性容器(i)可以是适于培养至少一个细胞群的任何类型的一次性容器。优选地，所述一次性容器是优选具有6孔、M孔、96孔、384孔或1535孔的微量滴定板。在特定实施方案中，所述一次性容器是耐热的，并且与热循环仪设备相容。裂解缓冲液(ii)是包含0. 05 M-IM离液剂的缓冲液。试剂本身优选是硫氰酸胍。任选地，试剂盒可以包含蛋白酶K，其以约0.05 - 5 mg/ml，优选0. 1-1 mg/ml的浓度存在于在裂解缓冲液中，或作为具有至少5倍的原液浓度的单独的试剂。同样任选地，试剂盒可以包含葡聚糖或非离子型去污剂(其优选是NP)，其以0.1 - 2 %的V/V量存在于裂解缓冲液中，或以至少5倍的原液浓度存在于分开的小瓶中。同样任选地，试剂盒可以主要含有双链特异性DNA酶，例如DNA酶I或虾核酸酶，其存在于分开的小瓶中，浓度是至少0. 02个单位。逆转录酶(iii)是专门的RNA依赖性DNA聚合酶，如AMV逆转录酶(Roche Applied Science 目录号 11 495 062)、MMuLV 逆转录酶(Roche Applied Science 目录号 Oil 062 603)和重组 Transcriptor 逆转录酶(Roche Applied Science 目录号 03 531 317)。组分 (iii)也可以是1步RT PCR酶，例如，生氢氧化碳嗜热菌的DNA聚合酶，或逆转录酶和耐热 DNA依赖性DNA聚合酶的混合物。本发明的试剂盒可以包含缓冲液、第一链cDNA合成所需的脱氧核苷三磷酸，以及各自的引物，如寡-dT引物、随机六聚体引物，或甚至特异性引物。与聚合酶一起，这些试剂中的一种、几种或全部，可以组合到一个小瓶中，作为各自的主混合物。此外，本发明的这样的试剂盒可以包含耐热DNA聚合酶，如Taq聚合酶，和进行扩增反应所必需的所有其他试剂，包括但不限于缓冲试剂、另外的脱氧核苷三磷酸，以及序列特异性扩增引物。此外，试剂盒可以包含在杂交qPCR过程中检测扩增子所必需的试剂，例如至少一个荧光标记的杂交探针或双链荧光染料。
实施例实施例1
以每个小瓶大约1000或250个细胞，将小鼠星形胶质细胞以两种不同的浓度(1:1， 1:4)接种到384孔细胞培养板中。约96小时后，除去培养基，用冷PBS洗涤细胞。加入2μ1 裂解缓冲液，将细胞在室温下温育10分钟。裂解缓冲液的组成如下 0. 2Μ硫氰酸胍 10 ng/ul聚肌苷酸
加入 Transcriptor RT 试剂(Roche Applied Science 目录号 03 531 317)到终 RT 体积为20μ1。在无RT对照中，从RT混合物省略了逆转录酶。根据以下热循环流程，温育含 RT反应的细胞培养板 25°C下10分钟 55°C下30分钟 85 °C下5分钟在冰上冷却
随后，在无核酸酶的水中将cDNA稀释到50μ1。用LightCycler 480 SYBR Green I Master 预混合物(Roche Applied Science 目录号 04 707 516)和适于扩增 ACTB 和 18S rRNA的弓丨物(TATAA Biocenter,内源对照基因系列(endogenous control gene panel)) 在 10μ1 PCR 中分析 2μ1 cDNA。在 LightCycler 480 实时 PCR 仪(Roche Applied Science 目录号05 015 278)上对ACTB和18S rRNA基因的表达进行定量，并且根据制造商的说明书测定Ct值。低Ct值对应高度表达。
表1:获自1:1稀释的Ct值
权利要求
1.进行用于扩增靶RNA的RT-PCR的方法，该方法包括以下步骤a)在细胞培养容器中培养贴壁细胞群，b)在所述样品容器中用包含0.05M-I M离液剂的裂解缓冲液裂解推测含有所述靶 RNA的所述贴壁细胞群，c)在所述样品容器中加入进行逆转录反应所必需的试剂，使得所述离液剂在所述样品容器中以约10-60 mM的浓度存在，并且将所述靶RNA逆转录为第一链cDNA，d)通过进行多个循环的热循环流程，扩增所述第一链cDNA。
2.权利要求1的方法，其中实时监测扩增步骤。
3.权利要求1-2的方法，其中所述离液剂是硫氰酸胍。
4.权利要求1-4的方法，其中所述裂解缓冲液包含约0.2-0. 5M的离液剂。
5.权利要求1-4的方法，其中步骤b)在非离子型去污剂的存在下进行，所述去污剂优选是NP40，并且其中在步骤c)中，所述非离子型去污剂具有0. 1-2 %&V/V。
6.权利要求1-5的方法，其中在步骤b)和c)之间加入DNA酶。
7.权利要求1-6的方法，其中在步骤b)中或在步骤c)之前加入蛋白酶K。
8.试剂盒，其包含-用于培养至少一个细胞样品的一次性容器， -裂解缓冲液，其任选包含离液剂 -包含逆转录酶活性的DNA聚合酶。
9.权利要求8的试剂盒，进一步包含至少一种另外的组分，所述组分选自非离子型去污剂、碳水化合物、DNA酶和蛋白酶。
全文摘要
本发明涉及进行用于扩增靶RNA的RT-PCR的方法，该方法包括以下步骤(i)在细胞培养容器中培养贴壁细胞群，(ii)在所述样品容器中用包含0.05M-1M离液剂的裂解缓冲液裂解推测含有所述靶RNA的所述贴壁细胞群，(iii)在所述样品容器中加入进行逆转录反应所必需的试剂，使得所述离液剂在所述样品容器中以约10-60mM的浓度存在，并且逆转录所述靶RNA，和(iv)通过使所述样品进行多个循环的热循环流程，扩增所述第一链cDNA。
文档编号C12Q1/68GK102112631SQ200980130405
公开日2011年6月29日申请日期2009年7月30日优先权日2008年8月1日
发明者L.斯特雷姆博姆, M.库比斯塔, N.佐里克申请人:塔塔生物中心有限公司, 霍夫曼-拉罗奇有限公司

文档序号 : 【 580830 】

技术研发人员：Ｍ．库比斯塔
技术所有人：霍夫曼－拉罗奇有限公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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Ｍ．库比斯塔丨霍夫曼－拉罗奇有限公司

用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法新型蛋白酶及其应用的制作方法