用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法
用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法本发明涉及用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法和组件(assembly)。预想的一个应用领域具体为可包含细菌或病毒，和更通常地，任何核酸的生物学 样本的快速分析。已知的电化学检测方法已使证明靶核酸序列称为可能。有人使用核酸扩增方法， 例如PCR(聚合酶链式反应)类型的方法，和循环伏安方法。根据这些方法中的一种，提供 包含核酸的生物学样本，所述核酸显示预定的靶核苷酸序列，并向生物学样本加入能氧化 靶序列中至少一个核苷酸碱基的氧化剂。扩增装置包含包括可氧化核苷酸碱基的核苷酸类 型，和当然意图在执行扩增方法的过程中被消耗的核苷酸，从而产生复制的核酸序列。同 时，或者在每个扩增步骤后，对样本施加电场，使氧化剂与可氧化核苷酸碱基反应，并测量 因此通过样本的电流。根据这种方法(文件PCT/FR2007/000373中有更具体的描述)当电 流随着扩增的过程而降低时，确定存在预定的靶序列及其初始量。这是因为，在扩增过程 中，扩增装置的游离核苷酸的数目由于并入合成的核酸中而降低。然后氧化剂只与越来越 有限量的游离核苷酸反应。因此，由于氧化反应的发生，电子传递越来越少，并且电流下降。因此，这种方法使得在任何生物学样本中快速检测和定量给定核酸的存在成为可 能。出现的并且本发明旨在解决的问题不仅在于提供另一种电化学检测方法，其使得 在生物学样本中检测靶核苷酸序列的存在成为可能，而且在于能鉴定其性质并将其定量。为了解决这个问题，根据第一方面，本发明提出用于电化学鉴定靶核苷酸序列的 方法。所述方法是根据如下类型(said method is of the type accoding towhich)提 供可包含的预定的靶核苷酸序列生物学样本，作为可激活扩增装置包含游离核苷酸以引起 所述预定的靶核苷酸序列的复制，和形成复制的靶核苷酸序列。根据本方法，还提供能与所 述核苷酸反应的可氧化还原的化合物，并使所述可氧化还原的化合物与所述生物学样本接 触。然后激活所述可激活的扩增装置，并对所述样本施加电场以激活所述可氧化还原的化 合物，并测量通过所述样本的代表所述可氧化还原的化合物的电化学活性的电流。因此，如 果电流下降则确定存在所述预定的靶核苷酸序列。根据本发明，提供能在复制过程中插入 形成所述复制的靶序列的核苷酸之间的可氧化还原的化合物，所述复制的靶序列引起所述 插入的可氧化还原的化合物的电化学活性的抑制，电流因此下降。除了游离核苷酸，可激活扩增装置包括引物，其为对于待检测的靶核苷酸序列有 特异性或互补的寡核苷酸，和聚合酶。此外，如后文将详细解释的，通过使电极接触所述样 本和通过在这些电极之间施加电势差而对所述样本施加电场。因此，本发明的一个特点是提供不会氧化样本中游离核苷酸的核苷酸碱基的可氧 化还原的化合物，如同上述现有技术文件中的情况，但是其将插入形成复制的靶序列的核 苷酸之间。优选地，根据连续的扩增循环激活所述可激活的扩增装置和，在每个扩增循环，将 所述复制的靶序列加倍。然后可氧化还原的化合物插入形成所述复制的靶序列的核苷酸之 间，并相对于施加的电场而损失其可氧化还原的活性。因此，在扩增循环的过程中，测量的电信号下降。然后有利地记录与电流下降相对应的扩增循环数，从而确定所述样本中所述靶核 苷酸序列的浓度。这是因为测量的信号的下降与复制的靶核苷酸序列的量成比例。由此比 例可以推导出初始存在于所述样本中的预定的靶核苷酸序列的量。因此，根据一定的扩增 循环数重复所述可激活扩增装置的激活，并且记录电流下降时所述扩增装置的循环数，以 确定样本中所述靶核苷酸序列的浓度。特别地，生物学样本包含的预定的靶核苷酸序列越 多，使电流强度下降所需要的扩增循环数越少。相反，样本包含的预定的靶序列越少，扩增 循环数越多。即，如同本说明书其它部分将更详细解释的，这种方法还使在生物学样本中定 量预定的靶序列的浓度成为可能。应详细说明的是，术语“可氧化还原的化合物”不仅描述氧化还原化合物，还描述 能够在某些条件下被氧化和在其它条件下被还原的化合物。根据本发明的一个特别有利的实施方案，在已经扩增出预定的靶核苷酸序列后， 还向所述样本提供热能，以引起所述插入的可氧化还原的化合物的释放，并且向所述样本 施加电场，以同时记录经过所述样本的电流的变化。然后确定与记录的电流的最大变化相 对应的热能Q的量，以鉴定所述预定的靶核苷酸序列的性质。有利地，以这样的方式向所述 样本提供热能使得引起所述样本温度的渐增。因此，将电流变化记录为所提供热能的函数， 或者更具体地记录为给定范围内温度的函数。由在给定温度的电流的最大变化，鉴定所述 预定的靶核苷酸序列的性质。这是因为，根据扩增的靶序列的性质，在给定温度的电流的最 大变化是所述复制的靶核苷酸序列的特征。因此，当向样本和，由此向复制的靶核苷酸序列提供足够的热能时，复制的靶核苷 酸序列的双链倾向于分离成两条单链并因此释放插入的可氧化还原的化合物，然后所述化 合物恢复电化学活性。在给定的热震荡，即在给定的温度，复制的靶核苷酸序列的双链彼 此分离，从而在向样本提供给定量的热能时，突然以几乎不连续的方式，即，在窄的温度范 围内发生可氧化还原的化合物的释放，然后通过在电极处产生的电流测量所述化合物的释 放。有利地，以这样的方式向所述样本提供热能使得引起所述样本温度的渐增，例如 40°C-98°C。在这个温度范围内，复制的靶核苷酸序列的双链将逐渐从配对状态(其中复制 的靶序列的每个核苷酸碱基都以互补方式相结合)转变为解离状态(其中每个复制的靶序 列将最终成为单链)。因此由双链状态到单链状态的改变发生在窄的温度范围内，其通过 “解离”温度表征，通常记作Tm，是复制的靶核苷酸序列的性质的特征。此外，优选在所述样本的预定的温度测量代表所述可氧化还原的化合物的电化学 活性的电流，在该温度没有其它形成的或正在形成过程中的分子抑制可氧化还原的化合 物，例如引物二聚体。有利地，所述预定的温度明显低于，但仍然接近与热能Q的预定量相 对应的所述样本的温度，使得，在这个高的温度，所有其它分子(其大小小于复制的靶核苷 酸序列)去杂交化，而复制的靶核苷酸序列保持完整。用这种方式，将由各种引物二聚体或 任何其它更小的分子释放所述可氧化还原的化合物(已经供应的热能使其可能解离)而导 致的电流量，从测量的电流中消除。优选地，使用伏安法测量并记录电流或电流的所述变化。这种动电位法 (potentiodynamic method)包括在两个电极之间，如在本说明书的其余部分将更详细解释的，施加随时间可变的电势，并随之记录由其产生的电流的变化。优选地，使用方波伏安法。 其它电化学技术当然也可能应用，例如示差脉冲伏安法或线性或循环扫描伏安法或其它取 样电流伏安法或交流电伏安法。根据本发明的一个特别有利的实施方案，提供的所述可氧化还原的化合物是过渡 金属的复合物，例如门捷列夫表第VIIIA列的金属，和更具体地，锇。此外，可氧化还原的化 合物有利地具有至少一个核酸序列插入配体，和例如二吡啶并吩嗪配体，其能插入由复制 的靶核苷酸序列形成的配对链之间。此外，可氧化还原的化合物具有至少一个二吡啶配体和有利地两个这类配体。锇 与相伴的二吡啶并吩嗪配体或两个相伴的二吡啶配体形成的复合物将在本说明书的其余 部分更详细地描述。此外，可以观察到一些完全有机的可氧化还原的化合物也能有益地使 用；其为，例如，亚甲基蓝的情况。根据本发明的一个优选实施方案，引起了所述预定的靶核苷酸序列的复制和复制 的靶核苷酸序列以核酸双链形式的形成。因此，所述可激活扩增装置为PCR类型的。根据第二方面，本发明提出用于电化学鉴定靶核苷酸序列的组件。所述组件包括 用于接收可包含预定的靶核苷酸序列的生物学样本的装置，和包含游离核苷酸以引起所述 预定的靶核苷酸序列复制和复制的靶核苷酸序列的形成的可激活扩增装置。此外，组件包 括能与所述核苷酸反应的可氧化还原的化合物，所述可氧化还原的化合物与所述生物学样 本接触。激活装置使得激活所述可激活扩增装置成为可能，并且该装置可以以这样的方式 对所述样本施加电场使得激活所述可氧化还原的化合物，而测量装置使得测量代表所述可 氧化还原的化合物的电学活性的经过所述样本的电流成为可能。最后，确定装置使得如果 电流下降则确定存在所述预定的靶核苷酸序列成为可能。根据本发明，所述可氧化还原的 化合物选自能在复制期间插入形成所述复制的靶序列的核苷酸之间，即复制的靶核苷酸序 列的双链中的化合物，所述复制的靶序列引起所述插入的可氧化还原的化合物电化学活性 的抑制，电流因此下降。此外，并且根据一个有利的实施方案，鉴定组件还包含用于以这样的方式向所述 样本提供热能使得引起所述插入的可氧化还原的化合物释放的装置，和用于通过电极接触 样本而以这样的方式向所述样本施加电场使得同时记录经过所述样本的电流变化作为温 度的函数的装置，以及用于确定与记录的电流的最大变化相对应的热能的量以检查预定的 靶核苷酸序列的存在的装置。这些装置根据记录的电流的最大变化，确定作为待检测靶核 苷酸序列存在的特征的解离温度(Tm)。上述电化学鉴定组件，其使得根据本发明执行所述 方法成为可能，将在后面的叙述中更详细地解释。特别地，将描述激活装置，其有利地能根 据连续扩增循环激活所述可激活扩增装置，以使所述复制的靶序列在每个扩增循环加倍。 此外，根据本发明的鉴定组件包括用于以这样的方式记录与电流下降相对应的扩增循环数 使得确定所述样本中所述靶核苷酸序列的浓度的记录装置。此外，本发明的其它特点和优势将在阅读下文提供的对本发明的特定实施方案的 描述中体现，所述实施方案参照附图，以非限制性指示的方式给出-
图1是根据本发明的电化学鉴定组件的示意图；-图2A至2C是根据一个可变实施方案，图1中所示鉴定组件的要素的示意图；-图3A和;3B是通过图1所示鉴定组件获得的强度/电势-图3C是通过推导图3A和;3B中所示的图而获得的图。-图4是与图3C类型相似的图。-图5A阐释通过图1和第一步中所示鉴定组件获得的强度/温度图。-图5B阐释通过转换图5A中所阐释的图在第二步中获得的图。-图6阐释图5B所代表的类型在具体应用中的图。 根据本发明的电化学鉴定方法要求使用电化学鉴定组件，其一方面包括，控制和 测量装置，其将首先描述，和另一方面包括特定的生物学和化学组分。因此，根据本发明的 电化学鉴定设备10示于图1中。此图1显示了两个微池12、14，其内部适合于接收生物学 样本，所述样本的性质将在后文定义。这些微池12、14，其根据现有技术是已知的，分别具 有底部16、18，其上存在电极20、对电极22和未显示的参照电极，所述电极通过，例如筛网 印制获得，并分别连接至稳压器24，前两者通过导线沈、观连接。此外，它们夹心在支撑 它们的Pelletier-效应模块32和与发生器34连接的加热帽30之间。如后文将解释的， Pelletier-效应模块32使得为微池12、14的内容物提供给定量的热能成为可能。此外，发 生器34和稳压器M受微型计算机36的控制，所述计算机包含计算机程序和记录装置。因此，这些微池12、14构成能接收生物学样本的接收装置，其中所述生物学 样本可包括核酸序列，特别是DNA，其包含意图检测的预定的靶核苷酸序列。此外， Pelletier-效应模块32，和能受微型计算机36控制的发生器34，构成可激活扩增装置的第 一部分，第二部分包含生物材料和化学物质。当然，其它公知的接收装置，其未示出，包括插入放置生物学样本的基底的管。然 后为管配备能在这种生物学样本中浸入并与稳压器连接的电极。然后意欲将管安装在热循 环器中以使生物学样本达到预定的温度并遵循预定的时间循环。其它接收装置，如图2A至 2C所阐释的，使得接收生物学样本成为可能。它们包含小尺寸的容器11，例如管盖，如图2A 所示，其能包含例如从 μ 至lml，并且其上部13为开放的。它能接收反应混合物。然后 通过膜15将其密封，所述膜上筛网印制了三个未连接的电极17、19、21。电极17、19、21朝 向容器11内侧并且由此出现在容器边缘和膜15之间的结合点。接着，然后将具有膜15的 容器11翻转，使其背对Pelletier-效应模块，并且因此，起初在容器11底部的反应混合物 接触电极17、19、21，所述电极浸入所述混合物中。本文使用的扩增方法是“PCR”方法。因此，通过Pelletier-效应模块32，微池12、 14的内部能达到预定的温度，保持同样是预定的一段时间并遵循下述规程该规程以根据 聚合酶类型进行的1至15分钟的第一阶段开始，其中微池12、14的内部达到94-95°C的温 度；接着，根据检测复制的靶核苷酸序列所需的扩增，对微池12、14进行一定次数的温度连 续循环，通常为10-50个循环，根据每个循环四个连续阶段进行，第一个“变性”阶段通常为 在94-95°C的1至60秒；第二个“引物退火”阶段，通常为在40°C _72°C的1至60秒，特征 为对预定的靶核苷酸序列特异性的引物；第三个“延伸”阶段，通常为在72°C 1至60秒，和 在40°C _95°C的温度几秒钟的最终阶段，其由电化学测量所需的时间确定。执行此第一扩 增-装置部分的条件将在下文，在描述第二部分后描述，所述第二部分包括，特别地，生物 材料和化学物质(化合物)。因为本发明的目标之一是通过复制扩增核酸序列并在扩增方法过程中电化学测 量其在介质(medium)中的存在，首先可取的是具有能进行这种扩增的生物材料。为了进行PCR技术，可取的是使待扩增核酸接触聚合酶、引物对和构成DNA的四种游离核苷酸dGTP、 dATP、dTTP和dCTP，所述游离核苷酸分别是脱氧鸟苷三磷酸、脱氧腺苷三磷酸、脱氧酪氨酸 三磷酸和脱氧胞苷三磷酸。也可以使用脱氧核糖核苷酸三磷酸类型的碱基的类似物，比如 脱氧-去氮-鸟苷三磷酸。因此，根据本申请的第一个实例，除了待检测的生物学样本和事实上包含283个 碱基对的靶核酸序列的巨细胞病毒DNA提取物之外，将DNA聚合酶(即酶)、引物和四类核 苷酸引入微池12，全部形成反应混合物，其当然为液体并已缓冲。此外，为了能测量电信号 的强度，向反应混合物加入可氧化还原的化合物，所述可氧化还原的化合物，在相关的情况 中，是锇复合物双0，2’-二吡啶)二吡啶并[3，2-a:2’，3’-c]吩嗪锇(II)，其CAS号可 为3555395-37-8，在本情形表示为[Osn(bpy)2DPPZ]2+，并且其化学式为式I
权利要求
1.用于电化学鉴定靶核苷酸序列的方法，所述方法是根据如下类型-提供生物样品，其中可包含预定的靶核苷酸序列；-提供包含游离核苷酸的可激活的扩增装置，以引起所述预定的靶核苷酸序列的复制 和复制的靶核苷酸序列的形成；-提供能与所述核苷酸反应的可氧化还原的化合物，并使所述可氧化还原的化合物与 所述生物学样本接触；-激活所述可激活扩增装置；-对所述样本施加电场以激活所述可氧化还原的化合物，并测量代表所述可氧化还原 的化合物的电化学活性的电流，所述电流经过所述样本；和-如果电流减弱，则确定存在所述预定的靶核苷酸序列；所述方法的特征在于提供能在复制期间在形成所述复制的靶序列的核苷酸之间插入 的可氧化还原的化合物，所述复制的靶序列引起所述插入的可氧化还原的化合物的电化学 活性的抑制，由此电流减弱。
2.根据权利要求1的鉴定方法，其特征在于根据连续扩增循环激活所述可激活的扩增 装置，而且在于，在每个扩增循环所述复制的靶序列加倍。
3.根据权利要求2的鉴定方法，其特征在于记录与电流减弱相对应的扩增循环数，从 而确定所述样本中所述靶核苷酸序列的浓度。
4.根据权利要求1至3中任一项的鉴定方法，其特征在于其还包括下述步骤-为所述样本提供热能，以引起所述插入的可氧化还原的化合物的释放，并且对所述样 本施加电场，以同时记录经过所述样本的电流的变化；和-确定与记录的电流中最大变化相对应的热能Q的量，从而鉴定所述预定的靶核苷酸 序列的性质。
5.根据权利要求4的鉴定方法，其特征在于向所述样本提供热能以引起所述样本温度 的逐渐升高。
6.根据权利要求5的鉴定方法，其特征在于所引起的温度的逐渐升高是在40°C-98°C。
7.根据权利要求1至6中任一项的鉴定方法，其特征在于在所述样本的预定的温度测 量代表所述可氧化还原的化合物的电化学活性的电流。
8.根据权利要求5或6和7的鉴定方法，其特征在于所述预定的温度显著低于与热能 Q的预定量相对应的所述样本的温度。
9.根据权利要求1至8中任一项的鉴定方法，其特征在于使用伏安法测量所述电流。
10.根据权利要求9的鉴定方法，其特征在于使用方波伏安法。
11.根据权利要求1至10中任一项的鉴定方法，其特征在于提供的所述可氧化还原的 化合物是过渡金属的复合物。
12.根据权利要求11的鉴定方法，其特征在于所述可氧化还原的化合物具有至少一个 核酸序列插入配体。
13.根据权利要求11或12的鉴定方法，其特征在于所述可氧化还原的化合物具有二吡 啶并吩嗪配体。
14.根据权利要求11至13中任一项的鉴定方法，其特征在于所述可氧化还原的化合物 具有至少一个二吡啶配体。
15.根据权利要求1至14中任一项的鉴定方法，其特征在于引起所述预定的靶核苷酸 序列的复制和核酸双链形式的复制的靶核苷酸序列的形成。
16.根据权利要求1至15中任一项的鉴定方法，其特征在于所述可激活扩增装置是 PCR类型的。
17.用于通过电化学方法鉴定靶核苷酸序列的组件，所述组件包括-用于接收生物学样本的装置(12，14)，所述样本可包含预定的靶核苷酸序列；-可激活的扩增装置，其包含游离核苷酸，以引起所述预定的靶核苷酸序列的复制和复 制的靶核苷酸序列的形成；-能与所述核苷酸反应的可氧化还原的化合物，所述可氧化还原的化合物与所述生物 学样本接触；-用于激活所述可激活扩增装置的激活装置(32，34，36)；-用于对所述样本施加电场以激活所述可氧化还原的化合物的装置00，22，24, 26, 观，36)，和用于测量代表所述可氧化还原的化合物的电化学活性的电流的装置，所述电流 经过所述样本；和-用于如果电流减弱则确定存在所述预定的靶核苷酸序列的装置04，36)；其特征在于所述可氧化还原的化合物选自能在复制期间插入形成所述复制的靶序列 的核苷酸之间的化合物，所述复制的靶序列引起所述插入的可氧化还原的化合物电化学活 性的抑制，由此电流减弱。
18.根据权利要求17的鉴定组件，其特征在于所述激活装置(32，34，36)适合于根据连 续扩增循环激活所述可激活扩增装置，从而在每个扩增循环使所述复制的靶序列加倍。
19.根据权利要求18的鉴定组件，其特征在于还包括记录装置(36)，其用于记录与电 流减弱相对应的扩增循环数以确定所述样本中所述靶核苷酸序列的浓度。
20.根据权利要求17至19中任一项的鉴定组件，其特征在于还包括-用于为所述样本提供热能以引起所述插入的可氧化还原的化合物释放的装置(32)， 和用于对所述样本施加电场以同时记录经过所述样本的电流的变化的装置(20，22，对，26， 28，36)；和-用于确定与记录的电流中最大变化相对应的热能的量以鉴定所述预定的靶核苷酸序 列的性质的装置。
全文摘要
本发明涉及用于靶核酸序列电化学检测的方法和集合。根据所述方法，提供可能包含核酸的生物样品，所述核酸能包含靶序列，所述生物样品与氧化剂混合，所述靶序列包括至少一个能由所述氧化剂氧化的核苷酸碱基；提供能与所述靶序列结合的互补装置；根据本发明，所述互补装置包括适于复制所述靶序列的可激活的扩增装置，所述扩增装置包括至少包括所述核苷酸碱基的核苷酸，其中所述核苷酸能在复制过程中消耗以构成复制核酸；并且通过对所述样品施加电场并记录电流的降低而确定所述靶序列的存在。
文档编号C12Q1/68GK102112630SQ200980130393
公开日2011年6月29日 申请日期2009年6月4日 优先权日2008年6月5日
发明者蒂鲍特·德费弗, 贝努瓦·里默格斯, 达米恩·马查尔 申请人:国家科学研究中心, 巴黎大学迪德罗特第七分校
文档序号 :
【 580829 】
技术研发人员：贝努瓦·里默格斯
技术所有人：巴黎大学迪德罗特第七分校
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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