一种干细胞与玻尿酸的组合物与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及美容医学【技术领域】，尤其涉及一种医用组合物与应用。本发明提供医用组合物中包括间充质干细胞和玻尿酸。该组合物不但能够在注射后立即生效，且持续时间长。实验证明：30天后，注射了本发明提供的组合物的裸鼠体内制剂体积和湿重显著(P<0.05)高于玻尿酸组和干细胞组。表明本发明提供的组合物，在注射初期即能达到立即生效的作用，而在注射一段时间后，仍能保持良好的效果。能够同时兼具起效快、持续时间长的特点。
【专利说明】一种干细胞与玻尿酸的组合物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及美容医学【技术领域】，尤其涉及一种医用组合物与应用。
【背景技术】
[0002] 玻尿酸是由双糖单位（葡萄醛酸-N-乙硫氨基葡糖）组成的直链高分子多醣，是 一种组织中自然存在的物质。自然界中广泛地存在于脊椎动物的结缔组织、粘液组织、目艮 球之晶状体及某些细菌的夹膜中，在组织结构上整体的保养或是细胞之间的运送都具有很 重要的功能。特别是在人类皮肤的真皮层中扮演了基质的重要角色，负责保留皮肤的水分。 但是，随着年龄的增加，玻尿酸在体内的存量减少，皮肤就会出现皱纹、松弛、缺乏弹性的问 题。利用玻尿酸填补受损的胶原纤维，可将肌肤填满撑起，皮肤进而有往上拉提的作用，从 而使皮肤滋润光滑、柔软而富有弹性，让肌龄年轻，延缓衰老。天然玻尿酸与人体内玻尿酸 的结构一致，可被人体完全分解不会残留体内对人体造成毒副作用，安全性高，因此，玻尿 酸作为整形、除皱材料目前被广泛的应用于美容行业中。但是，玻尿酸很容易被机体吸收， 注射玻尿酸所维持的效果约在6?9个月之间，为了能够长期维持塑形的效果需要多次注 射，增大了感染或排异反应出现的风险，且造成了更多的痛苦。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚 层，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受 到人们的关注。充质干细胞能够产生胶原蛋白，胶原蛋白的主要功能是提供具有高抗张强 度的纤维，增强肌肤锁水的作用，改善肌肤的内质结构，提高肌肤弹性与紧致性，并可以达 到局部生长塑形。因此，利用间充质干细胞分化成为自身的组织，永久的存在，可起到长期 塑形作用。但是，间充质干细胞作为美容整形材料，需要一段在体内分化的时间，不能如玻 尿酸般起到立竿见影的效果。
[0004] 因此，进一步研究能够快速起效且长期塑性的美容整形材料十分必要。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种医用组合物与应用，本发明提 供的组合物作为美容、整形或除皱的制剂能够快速起效且能够达到长期塑性的效果。
[0006] 本发明提供给的医用组合物包括：间充质干细胞和玻尿酸。
[0007] 在一些实施例中，玻尿酸的体积分数为80 %?90%。
[0008] 在另一些实施例中，玻尿酸的体积分数为85%。
[0009] 在一些实施例中，间充质干细胞的浓度为I. OX IO4个/mL?I. OX 10 7个/mL。
[0010] 在另一些实施例中，间充质干细胞的浓度为I. OX IO5个/mL。
[0011] 在另一些实施例中，间充质干细胞的浓度为1.0 X IO6个/mL。
[0012] 脂肪干细胞具有很好的自我复制能力，并且可以分化成脂肪细胞，成为皮肤组织 的一部分，另外脂肪干细胞分泌出很多细胞因子，有利于皮肤保持良好的弹性，但是，脂肪 干细胞在体内的分化需要时间，因此，注射后需一段时间才能起效。玻尿酸作为注射用的组 织填充物，用于改善面部皱纹，面部微整形，以及矫正外伤或青春痘留下真皮层的疤痕，注 射后立刻起效，但在人体内可以被降解、吸收，持续时间短，一般只能维持3个月?4个月。 而本发明提供的组合物注射后可以同时具备玻尿酸的快速起效和干细胞持续时间长的优 点。
[0013] 在一些实施例中，间充质干细胞为脂肪干细胞。
[0014] 本发明提供的组合物中的间充质干细胞可为自制也可为市场购得，本发明对此不 作限定，但其实施皆在本发明的保护范围之内。
[0015] 在一些实施例中，脂肪干细胞的制备方法为：将脂肪组织经I型胶原酶消化后，培 养至80%融合，经胰酶消化后继代培养，获得脂肪干细胞。
[0016] 在另一些实施例中，I型胶原酶占所述脂肪组织的质量分数为0. 25%。
[0017] 在另一些实施例中，培养的培养基为含有15% FBS的DMEM-F12培养基；培养的接 种浓度为1.0105个/1^;培养的条件为371：、5%〇) 2、饱和湿度。
[0018] 在另一些实施例中，胰酶的量为5mg。
[0019] 在另一些实施例中，继代培养的培养基为含有15% FBS的DMEM-F12培养基；培养 的接种浓度为5. OX IO4个/mL ;培养的条件为37°C、5% CO2、饱和湿度。
[0020] 具体的，脂肪干细胞的制备方法包括以下步骤：
[0021] 步骤1 :将脂肪组织与质量分数为0. 5%的I型胶原酶混合，混合的体积比为1:1， 37°C、IOOrpm消化Ih后，加入FBS终止消化；
[0022] 步骤2 :1500rpm离心5min，弃除脂肪组织和含有I型胶原酶的FBS，以PBS清洗 后，以培养基重悬后培养至80%融合；重悬的浓度为I. OX IO5个/mL，培养的条件为37°C、 5% CO2、饱和湿度，24h后更新培养基后，每3天更新培养基；
[0023] 步骤3 :弃除培养基，加入质量分数为0. 25%的胰酶，37°C、5%C(y'f|K2min，以培 养基终止消化后，弃除培养基；
[0024] 步骤4 :以密度为5 X IO4个/mL接种于培养基，继代培养；
[0025] 培养基为含有FBS的DMEM-F12培养基，FBS的体积分数为15 %。
[0026] 本发明提供的干细胞与玻尿酸的组合物在制备美容、除皱、整形制剂中的应用。
[0027] 本发明提供的医用组合物中包括间充质干细胞和玻尿酸。本发明提供的组合物 兼具干细胞和玻尿酸在美容、除皱、整形中的优点，不但能够在注射后立即生效，且持续时 间长。经实验证实，3天时，注射了本发明提供的组合物的裸鼠和注射了玻尿酸的裸鼠体内 制剂体积和重量相差不大，但注射了脂肪干细胞的裸鼠未见新组织产生；10天时，注射玻 尿酸的裸鼠体内制剂体积和湿重皆出现降低现象，注射了本发明提供的组合物的裸鼠体内 制剂的体积和湿重略有增加，而注射了脂肪干细胞的裸鼠仍未见新组织产生；30天后，注 射了本发明提供的组合物的裸鼠体内制剂体积和湿重显著（P〈〇. 05)高于玻尿酸组和干细 胞组。表明本发明提供的组合物，在注射初期即能达到立即生效的作用，而在注射一段时间 后，仍能保持良好的效果。能够同时兼具起效快、持续时间长的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1示实施例1制备的脂肪干细胞表面抗原检测结果；其中，图l_a示抗原CD44 的检测结果；图Ι-a示抗原CD44的检测结果；图Ι-b示抗原CD73的检测结果；图1-c示抗 原CD90的检测结果；图1-d示抗原CD105的检测结果；图1-e示抗原CD34的检测结果；图 Ι-f示抗原⑶45的检测结果；图Ι-g示抗原HLA-DR的检测结果；
[0029] 图2示脂肪干细胞成脂诱导21天后分化结果；其中，图2-a示成脂诱导前脂肪干 细胞油红〇染色结果（IOX);图2-b示成脂诱导后脂肪干细胞油红0染色结果（IOX);
[0030] 图3示脂肪干细胞成骨诱导28天后分化结果；其中，图3-a示成脂诱导前脂肪干 细胞茜素红染色结果（IOX);图3-b示成脂诱导后脂肪干细胞茜素红染色结果（IOX)。
【具体实施方式】
[0031] 本发明提供了一种医用组合物与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当 改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是 显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行 了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0032] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0033] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0034] 实施例1脂肪干细胞的制备
[0035] 将人体脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL。
[0036] 每管中加入等体积的0. 5% I型胶原酶（终浓度为0. 25%)，充分混匀，封口，转移 至恒温空气摇床中，37°C、100R消化lh。
[0037] 每管加入4mL的FBS，终止消化，混匀。
[0038] 离心，1500rpm/min 离心 5min。
[0039] 离心后，取2mL的上层血液（中间层），分装至两个EP管中，分别留样送检。
[0040] 弃去上两层液体，每管加入40mL PBS重悬，重悬细胞。
[0041] 离心，1500rpm/min离心5min，弃去上清，获得脂肪干细胞。加入含15 % FBS的 DMEM-F12培养基重悬细胞，以I X IO5个/mL接种。
[0042] 轻轻前后摇动培养皿，使细胞悬液均勻分布于瓶底；将培养瓶做好标记并转移到 37°C、5% CO2、饱和湿度为95%的培养箱中培养。
[0043] 24h后首次换液，弃去悬浮细胞.随后每3天换一次液。
[0044] 在倒置显微镜下观察脂肪干细胞，若细胞融合达80 %，则对脂肪干细胞进行传代 处理，具体为：
[0045] 弃去培养基，加入PBS溶液5mL，轻轻前后摇动培养瓶，弃去PBS溶液（该步骤重复 2次）。
[0046] 每平皿加入2mL 0. 25%胰酶，把平皿移入C02培养箱内消化2min，消化后取出平 皿放置于显微镜下观察细胞形态。
[0047] 80%脂肪干细胞皱缩变圆、漂浮脱落，往平皿中加入51^15%?85的01^1^12，终 止消化。吸取IOuL细胞悬液进行细胞计数,计算出细胞总数。
[0048] 1500rpm离心5min，取2mT,上清分装至两EP管中，每管ImL。
[0049] 以细胞密度为5X IO4个/mL，计算出所需的15% FBS的DMEM-F12培养基的体积 重悬细胞，并接种至IOcm平皿，IOmL/平皿。轻轻前后摇动平皿，使细胞悬液均匀分布于瓶 底，37°C、5% CO2、饱和湿度为95%的培养箱中培养。
[0050] 实施例2脂肪干细胞的质量鉴定
[0051] 取实施例1制备的脂肪干细胞，分别进行表面抗原检测、成脂诱导分化、成骨诱导 分化，鉴定实施例1提供的脂肪干细胞的质量。
[0052] 1、脂肪干细胞的表面抗原检测
[0053] 检测采用流式细胞仪，分别检测实施例1提供的脂肪干细胞中⑶44、⑶73、⑶90、 CD105、CD34、CD45 及 HLA-DR 表达，具体为：
[0054] 取不同代数的脂肪干细胞，吸去培养基，0.25%胰酶常规消化，制成IXlO5的细 胞悬液，分别取抗人⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶34、⑶45及HLA-DR的单克隆抗体各5 μ L， 加入细胞悬液500 μ L，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心 5min，弃上清，用含10% FBS的PBS洗涤2遍，用500 μ L PBS重悬后上机检测。检测结果如 图1所示。结果显示：实施例1制备的干细胞中，⑶44、⑶73、⑶90、⑶105的表达量> 99%， 而⑶34、⑶45及HLA-DR的表达量小于1%。证明本发明实施例1制备的脂肪干细胞纯度 良好。
[0055] 2、脂肪干细胞成脂诱导分化
[0056] 取Ρ3代脂肪干细胞，消化，以IO6个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，24h后，细 胞贴壁并伸展，更换成脂分化培养基（含有DMEM-F12培养基、体积分数为10%胎牛血清、 10mg/L 胰岛素、1 μ mol/L 地塞米松、100 μ mol/L 吲哚美辛、500 μ mol/L IBMX)，含有 10%胎 牛血清的完全培养基组作为阴性对照。每3d更换1次培养基，定向分化诱导第21d后即可 以使用油红〇染色定性观察体外诱导分化的结果。结果如图2所示。结果显示，经21天的 诱导分化，干细胞成功的分化出了脂肪粒，表明实施例1制备的脂肪干细胞的活性良好。
[0057] 3、脂肪干细胞成骨诱导分化
[0058] 取P3代脂肪干细胞，消化，以IO6个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，24h后，细 胞贴壁并仲展，更换成骨诱导培养基（含有DMEM-F12、体积分数为10% FBS、0. lymol/L地 塞米松、50 μ mol/L抗坏血酸、lOmmol/L β -甘油磷酸），含有10%胎牛血清的完全培养基组 作为阴性对照。每3d更换1次培养基，定向分化诱导。第28d后即可以使用茜素红染色定 性观察体外诱导分化的结果。结果如图3所示。结果显示，经28天的诱导分化，干细胞成 功的分化出现了钙结节。表明实施例1制备的脂肪干细胞的活性良好。
[0059] 实施例3本发明提供的组合物功能鉴定
[0060] 一、本发明提供的组合物的制备：取实施例1制得的脂肪干细胞和玻尿酸按照表1 混合。
[0061] 表1各组分含量
[0062]
【权利要求】
1. 一种医用组合物，其特征在于，包括：间充质干细胞和玻尿酸。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述玻尿酸的体积分数为80 %?90 %。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞的浓度为1. 0X 10 4个/mL ?1. 0X107个/mL。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪干细胞。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞的制备方法为：将脂肪 组织经I型胶原酶消化后，培养至80%融合，经胰酶消化后继代培养，获得脂肪干细胞。
6. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述I型胶原酶占所述脂肪组织的质 量分数为0.25%。
7. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述培养的培养基为含有15% FBS的 DMEM-F12培养基；培养的接种浓度为1. OX 105个/mL ;培养的条件为37°C、5% C02、饱和湿 度。
8. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述胰酶的量为5mg。
9. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述继代培养的培养基为含有15% FBS 的DMEM-F12培养基；培养的接种浓度为5. OX 104个/mL ;培养的条件为37°C、5% C02、饱和 湿度。
10. 如权利要求1?9任一项所述的医用组合物在制备美容、除皱、整形制剂中的应用。
【文档编号】A61Q19/08GK104490727SQ201410718100
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 王小燕, 马岩岩, 卢瑞珊 申请人:广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
文档序号 :
【 1457669 】
技术研发人员：陈海佳,王一飞,葛啸虎,王小燕,马岩岩,卢瑞珊
技术所有人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：陈海佳,王一飞,葛啸虎,王小燕,马岩岩,卢瑞珊
技术所有人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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