猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体及其应用的制作方法

1.一种猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，其特征在于，以NCBI中CSN1S1基因参考序列(GenBank:EU025875.1)的25251-25981区域为左侧同源臂、25984-27112区域为右侧同源臂，在左侧同源臂的5’端引入NheI酶切位点，在右侧同源臂的5’端引入SalI酶切位点，右侧同源臂的3’端引入KpnI酶切位点，将T2A序列、猪LTF基因的CDS序列插入左右同源臂之间，从而构成同源重组定点插入片段的关键序列。

2.如权利要求1所述的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，其特征在于，基于Promega公司的pCI-neo Mammalian Expression Vector质粒，保留该质粒的T3启动子、SV40late polyadenylation signal、Phage f1region和β-内酰胺酶编码区序列为骨架，将同源重组定点插入片段序列与pCI质粒保留的骨架连接起来，从而获得猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体。

3.如权利要求1所述的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，其特征在于，包括按序列表中序列1所示的核苷酸序列合成环状的PCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒。

4.如权利要求3所述的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，其特征在于，右侧同源臂所在区域有SNP位点，在pCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒的基础上引入含有SNP位点的pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒，所述pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒为按序列表中序列2所示的核苷酸序列合成环状的PCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒。

5.一种利用权利要求1至4任一项所述的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体构建对细菌性的腹泻具有一定抗病能力的转基因猪的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过该载体将猪LTF基因CDS序列定点敲入到猪CSN1S1基因的终止密码子附近，从而实现以猪内源性CSN1S1基因启动子驱动猪LTF基因的表达。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述猪CSN1S1基因的终止密码子附近为内含子16-内含子18之间。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，通过PCR和TA克隆测序补平猪CSN1S1终止密码子下游长达100bp的Gap区域。

9.如权利要求5至8任一项所述的应用，其特征在于，采用同源转基因的策略，通过质粒载体转入的LTF基因为猪来源的基因。