猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体及其应用的制作方法

本发明涉及转基因动物(猪)育种技术领域，具体涉及猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体及其应用。

背景技术：

细菌性腹泻是造成哺乳仔猪与断奶仔猪死亡的重要原因。长期以来我国养猪业发生细菌性腹泻的频率高、范围广，导致仔猪成活率低、饲料报酬低、全群PSY低、生长发育缓慢甚至停滞，造成了巨大的经济损失；同时也在一定程度上造成了兽用抗生素滥用、抗生素残留超标、耐药性等食品药品安全问题及生态环境污染问题，对生态平衡和人类健康都构成了巨大的威胁。

Lactoferrin(LTF)能优化仔猪肠道菌群结构，还有促生长的作用。自然生理条件下猪乳中的LTF含量低(1.1-1.3mg/mL)，并且在产后一周内急剧下降，而α-S1-酪蛋白(α-S1-casein，CSN1S1)是猪乳汁中含量很高的组分。

研究表明：乳汁中表达猪LTF基因的母鼠哺育的小鼠在日增重、小肠液与血液中致病菌的数量、小肠微绒毛与肺泡的健康水平(形态)等方面都有极显著的改善；给7日龄小猪饲喂含人LTF的牛奶能优化小猪的肠道菌群结构、减少沙门氏菌和大肠杆菌菌群数量、提高乳酸杆菌菌群数量、提高小猪的平均日增重。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体及其应用，可直接应用于构建对细菌性的腹泻具有一定抗病能力的转基因猪，尤其能够提高仔猪对细菌性腹泻的抵抗力。

一种猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，以NCBI中CSN1S1基因参考序列(GenBank:EU025875.1)的25251-25981区域为左侧同源臂、25984-27112区域为右侧同源臂，在左侧同源臂5’端引入NheI酶切位点，在右侧同源臂的5’端引入SalI酶切位点，右侧同源臂的3’端引入KpnI酶切位点，将T2A序列、猪LTF基因的CDS序列插入左右同源臂之间，从而构成同源重组定点插入片段的关键序列。

进一步地，基于Promega公司的pCI-neo Mammalian Expression Vector质粒，保留该质粒的T3启动子、SV40late polyadenylation signal、Phage f1region和β-内酰胺酶编码区序列为骨架，将同源重组定点插入片段序列与pCI质粒保留的骨架连接起来，从而获得猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体。

进一步地，包括按序列表中序列1所示的核苷酸序列合成的环状的PCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒。

进一步地，右侧同源臂所在区域有SNP位点，在pCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒的基础上引入含有SNP位点的pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒，所述pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒为按序列表中序列2所示的核苷酸序列合成的环状的PCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒。

一种利用所述的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体构建对细菌性的腹泻具有一定抗病能力的转基因猪的应用。

进一步地，通过该载体将猪LTF基因CDS序列定点敲入到猪CSN1S1基因的终止密码子附近，从而实现以猪内源性CSN1S1基因启动子驱动猪LTF基因的表达。

进一步地，所述猪CSN1S1基因的终止密码子附近为内含子16-内含子18之间。

进一步地，通过PCR和TA克隆测序补平猪CSN1S1终止密码子下游长达100bp的Gap区域。

进一步地，采用同源转基因的策略，通过质粒载体转入的LTF基因为猪来源的基因。

本发明的有益技术效果有：

根据本发明构建的猪乳腺特异高表达猪LTF基因的定点敲入质粒载体，通过该质粒载体转入乳腺特异高表达猪LTF基因的母猪能有效提高其哺育的仔猪对细菌性腹泻的抵抗力，同时具有提高仔猪存活率、提高仔猪健康水平、促进仔猪生长发育、增加仔猪日增重等技术效果。本发明的应用对具有高经济价值的生物反应器及种猪都具有很高的潜在价值，对养猪业具有重大经济效益。

附图说明

图1是本发明实施例的同源重组定点插入片段的关键序列的组成结构；

图2是本发明实施例的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体总体结构；

图3是本发明实施例的pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒的总体结构。

具体实施方式

参阅图1，一种猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，以NCBI中CSN1S1基因参考序列(GenBank:EU025875.1)的25251-25981区域为左侧同源臂、25984-27112区域为右侧同源臂，在左侧同源臂5’端引入NheI酶切位点，在右侧同源臂的5’端引入SalI酶切位点，右侧同源臂的3’端引入KpnI酶切位点，将T2A序列、猪LTF基因的CDS序列插入左右同源臂之间，从而构成同源重组定点插入片段的关键序列。

参阅图2，在优选的实施例中，基于Promega公司的pCI-neo Mammalian Expression Vector质粒，保留该质粒的T3启动子、SV40late polyadenylation signal、Phage f1region和β-内酰胺酶编码区序列为骨架，将同源重组定点插入片段序列与pCI质粒保留的骨架100连接起来，从而获得猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体。

在优选的实施例中，按序列表中序列1所示的核苷酸序列合成环状的PCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒。

参阅图3，在优选的实施例中，右侧同源臂所在区域有SNP位点，在pCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒的基础上引入含有SNP位点的pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒，所述pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒为按序列表中序列2所示的核苷酸序列合成的环状的PCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒。

一种利用所述的猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体构建对细菌性的腹泻具有一定抗病能力的转基因猪的应用。

在优选的实施例中，通过该载体将猪LTF基因CDS序列定点敲入到猪CSN1S1基因的终止密码子附近，从而实现以猪内源性CSN1S1基因启动子驱动猪LTF基因的表达。

在优选的实施例中，所述猪CSN1S1基因的终止密码子附近为内含子16-内含子18之间。

在优选的实施例中，通过PCR和TA克隆测序补平猪CSN1S1终止密码子下游长达100bp的Gap区域。

在优选的实施例中，采用同源转基因的策略，通过质粒载体转入的LTF基因为猪来源的基因。

根据本发明的实施例，为提高仔猪对细菌性腹泻的抵抗力，我们构建了猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体，以通过该载体将猪LTF基因(CDS序列)定点敲入到猪CSN1S1基因的终止密码子附近(内含子16-内含子18之间)，从而实现以猪内源性CSN1S1基因启动子驱动猪LTF基因的表达。同时，为避免异源转基因潜在的伦理争议、物种生理内环境差异对蛋白活性的影响、以及生物安全性争议等问题，采用同源转基因的策略，通过质粒载体转入的LTF基因为猪来源的基因。

以NCBI中CSN1S1基因参考序列(GenBank:EU025875.1)的25251-25981区域为左侧同源臂、25984-27112区域为右侧同源臂，并通过高保真PCR和TA克隆测序首次补平了猪CSN1S1终止密码子下游长达100bp的Gap区域。为构建基因敲入载体质粒，在左侧同源臂5’端引入NheI酶切位点，在右侧同源臂的5’端引入SalI酶切位点，右侧同源臂的3’端引入KpnI酶切位点，将T2A序列、猪LTF基因的CDS序列插入左右同源臂之间，从而构成同源重组定点插入片段的关键序列，其结构如图1。

在此基础上，我们对Promega公司的pCI-neo Mammalian Expression Vector进行改造，保留该质粒的T3启动子、SV40late polyadenylation signal、Phage f1region和β-内酰胺酶编码区序列为骨架，将同源重组定点插入片段序列与pCI质粒保留的骨架100连接起来，从而获得猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体。质粒的总体结构如图2。

因为右侧同源臂所在区域有SNP位点，因此我们在pCI-pCas1-LTF-KI-M10质粒的基础上引入了含有SNP位点的pCI-pCas1-LTF-KI-M20质粒，其结构如图3。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学；中国人民解放军第三军医大学；深圳市金成实验动物科技有限公司

<120> 猪乳腺特异高表达乳铁蛋白基因的定点敲入质粒载体及其应用

<130> 16A100410JYC

<160> 2

<210> 1

<211> 6960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctagcaaca gaggcactat cctgaaattt cagaaaggaa aatggtttgg caccaaaact 60

ttataattag gaaaagataa tgtgttagga attggagaat tcttttccct ttattcctgg 120

catttctgag agcagaggta tggaccccga gtgggaggcc cttccttttg tttgagctca 180

gtgtcttcat ggaaaattaa gctaaagaac aaaatggcca aaaaagtcct ttccagtcca 240

catgtccatg aggttataaa ttttataata attaaattca cacccctaca ttcctctggg 300

ctctggtaac tggactccga ttagtaaatg cagattcgtg gagttcaatg ctgaatattg 360

accttgaaga agttatttct tcattactca caagtctccc aaaaagcact ttccaaaagt 420

tcctttgcca tgatccactg catggaagaa tgtgatttct ccattttcct tgcagagtag 480

atatctcttg tgatgctaat agccatgtca gaagtgaata aaatgcttct ttttttcaga 540

gattctaaag agcaatttcc catatcctgt tgctatttca ttctctctag cctctccacc 600

agttctacca gcttgatgcc tatccctatg ctacctggta ttatcctcca caatatattg 660

ctcacccatt attcaccaac atccctcaac ccactgcccc tgagaagggt ggaaaaactg 720

agattatgcc tcagtgggag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga 780

atcccggccc tatgaagctc ttcatccccg ccctgctgtt cctctggaca cttggactgt 840

gtctggctgc ccctaagaaa ggggttcgat ggtgtgtcat atccacagca gagtattcaa 900

aatgccgcca gtggcaatca aagataagaa gaactaatcc catcttctgc ataaggaggg 960

cttctcccac tgactgtatc cgggccatcg cggcaaaaag ggcagatgct gtgacccttg 1020

atggtggttt ggtgtttgaa gcaggccagt acaaactgcg gccggtagca gcggagatct 1080

acgggacaga agagaatccc caaacctact attatgctgt ggctgtagtg aagaaaggtt 1140

tcaactttca gctgaaccag ctacaaggtc gaaagtcctg ccacacaggc cttggcaggt 1200

ctgccgggtg gaatatccct atagggttac ttcgccggtt cttggactgg gcagggccac 1260

ctgagcccct ccagaaagct gtggccaaat tcttctctca gagctgtgtg ccctgcgcag 1320

atggaaatgc gtatcccaac ctgtgtcagc tgtgcatagg gaaagggaaa gataaatgtg 1380

cttgttcctc ccaggaaccg tattttggct attccggtgc cttcaactgt ctgcacaaag 1440

ggattggaga tgtggctttt gtcaaggaga gtacagtgtt tgagaacctg ccacagaagg 1500

ctgaccggga caaatacgag ctactctgcc cagacaatac tcgaaagcca gtggaagcat 1560

tcagggagtg ccaccttgcc cgggtccctt ctcatgctgt tgtggcccga agtgtgaatg 1620

gcaaggagaa ctccatctgg gagcttctct accagtcaca gaaaaagttt ggaaaaagca 1680

atccacagga gttccagctc tttggctctc ctggtcagca gaaggacctc ctgtttagag 1740

atgctaccat cgggtttttg aagatcccct caaagataga ttctaagctg tacctgggcc 1800

tcccgtacct tactgccatc cagggcctga gggaaacggc agcggaggtg gaggcgcggc 1860

aggcgaaggt cgtgtggtgc gccgtgggtc cagaggagct gcgcaagtgc cggcagtgga 1920

gcagccagag cagccagaac ctgaactgca gcctggcctc caccaccgag gactgcatcg 1980

tccaggtgct gaaaggagaa gctgatgcta tgagcttgga tggaggattt atctacactg 2040

cgggcaagtg tggtttggtg cctgtcctgg cagagaacca aaaatctcgc caaagcagta 2100

gctcagactg tgtgcataga ccaacacaag ggtattttgc cgtggcggtt gtcaggaaag 2160

caaatggtgg tatcacctgg aattctgtga gaggcacgaa gtcctgccac actgctgtgg 2220

acaggacagc aggctggaac atccccatgg gcctgcttgt caaccagaca ggctcctgca 2280

aatttgacga attctttagt caaagctgtg ctcctgggtc tcagccggga tccaatctct 2340

gtgcactgtg tgttggcaat gaccagggcg tggacaagtg tgtgcccaac agtaatgaga 2400

gatactatgg ttacaccggg gctttcaggt gcctggctga gaatgctggg gatgtggcgt 2460

ttgtgaaaga tgtcactgtc ttggacaaca cgaatggaca gaacacagaa gagtgggcca 2520

gggaattgag gtcagatgac tttgagctgc tgtgccttga tggcaccagg aagcctgtga 2580

ctgaggctca gaactgtcac ctggctgtgg cccccagtca tgctgtggtc tctcggaagg 2640

aaaaggcagc acaggtggaa caggtgctac tcactgagca ggctcagttt ggaagatacg 2700

gaaaagactg cccggacaag ttttgcttgt tccggtctga gaccaaaaac cttctgttca 2760

acgacaacac ggagtgtctg gcccaactcc aaggcaaaac aacatacgaa aaatatttgg 2820

gatcagagta tgtcacagcc atcgctaacc tgaaacagtg ctcagtctcc ccgcttctgg 2880

aagcctgtgc cttcatgatg aggtaaggta ccgtaagttc attttaatga ctgtatattg 2940

atgttctacc aaaggaaata aaagaaaact tcttaaagaa cataccataa aaacagattt 3000

agaataaaca tgacaaaatc aatatctaga gcgtcgtagt agaattttcc aaaatgggaa 3060

attggcagga cgttctgata tctgcagcta atgttaatcc actactcagg aacttgtgga 3120

gcagcgctct ctgttctttg agattcattc tgatgaagtc aggaaaaagt tttctatcca 3180

aagcaaaaac acagtaattt cattttatcc tccttacaat tttactaatc tctaaaggct 3240

tttcttttgg ttatatatac ccatgatata cattacaatt cagtgtgggg aataaagcac 3300

agattttggc atccaaaagt cccaaatcca aatcctgacc ttttttgctt acttaaaata 3360

atgcattaat gcttattttt ataattctga aggtgattaa agacaataat ctgttaagca 3420

tagtgctggg aagatacata gcagtcagtt tttattgatt tagtaaaatt gtactgctga 3480

ctatcttcat cacatgattt taagaatttt tgttttttca gaagaattaa gtgaattctc 3540

aggaactcca caattatggc ctttggtaag ttggaaatca tttgtggaac cattgatcct 3600

cttttcgttt aaagactcat tacaaagata ggactgtaga ctataaagat tttttttcct 3660

gtagttgagc tccttgtgga cacattagca cttagataat aattaaattg gcttggacat 3720

ttgcaaatgt ttgtttcata attatactat atgtaaatag caatcaaatt agataatttt 3780

aatgaatata atttattata ttgaacccct atacaagtat aggagcatga atgctactaa 3840

ttttccatca agatgtgacc ttgagatgct ggtaaactca acagtgggat tctatttttt 3900

atgatcacta caataaaaat ccttagcaag tcatgtgata aaaccaagta tttgtttctc 3960

aacaagaaaa cagactttaa cgtctacaga cttgttttaa ttaacttcat ccattgtact 4020

ggtgtttccg attgtatgtc agtcgacccg ggcggccgct tcgagcagac atgataagat 4080

acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 4140

aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 4200

acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga gatgtgggag gttttttaaa 4260

gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtaaaa tcgataagga tccgggctgg cgtaatagcg 4320

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggacgc 4380

gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 4440

acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 4500

cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 4560

tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 4620

gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 4680

cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 4740

gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 4800

gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 4860

ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 4920

tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 4980

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 5040

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 5100

taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 5160

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5220

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 5280

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5340

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 5400

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 5460

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 5520

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 5580

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 5640

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 5700

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 5760

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 5820

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 5880

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5940

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 6000

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 6060

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 6120

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6180

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6240

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6300

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6360

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6420

agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6480

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6540

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 6600

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 6660

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 6720

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 6780

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 6840

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 6900

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatggc tcgacagatc 6960

<210> 2

<211> 6960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgggcggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa 60

ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 120

taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc 180

aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta 240

aaatcgataa ggatccgggc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 300

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 360

gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 420

tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 480

tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 540

tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 600

gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 660

ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 720

aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac 780

aatttcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg 840

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 900

acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 960

gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 1020

agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 1080

tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 1140

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 1200

taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 1260

tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 1320

gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 1380

atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 1440

ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 1500

cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 1560

ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 1620

aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 1680

ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 1740

gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 1800

ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 1860

gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 1920

ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 1980

tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 2040

cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 2100

tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 2160

atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 2220

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 2280

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 2340

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt 2400

cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 2460

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 2520

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 2580

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 2640

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 2700

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 2760

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 2820

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 2880

tgctggcctt ttgctcacat ggctcgacag atcgctagca acagaggcac tatcctgaaa 2940

tttcagaaag gaaaatggtt tggcaccaaa actttataat taggaaaaga taatgtgtta 3000

ggaattggag aattcttttc cctttattcc tggcatttct gagagcagag gtatggaccc 3060

cgagtgggag gcccttcctt ttgtttgagc tcagtgtctt catggaaaat taagctaaag 3120

aacaaaatgg ccaaaaaagt cctttccagt ccacatgtcc atgaggttat aaattttata 3180

ataattaaat tcacacccct acattcctct gggctctggt aactggactc cgattagtaa 3240

atgcagattc gtggagttca atgctgaata ttgaccttga agaagttatt tcttcattac 3300

tcacaagtct cccaaaaagc actttccaaa agttcctttg ccatgatcca ctgcatggaa 3360

gaatgtgatt tctccatttt ccttgcagag tagatatctc ttgtgatgct aatagccatg 3420

tcagaagtga ataaaatgct tctttttttc agagattcta aagagcaatt tcccatatcc 3480

tgttgctatt tcattctctc tagcctctcc accagttcta ccagcttgat gcctatccct 3540

atgctacctg gtattatcct ccacaatata ttgctcaccc attattcacc aacatccctc 3600

aacccactgc ccctgagaag ggtggaaaaa ctgagattat gcctcagtgg gagggcagag 3660

gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccctatgaag ctcttcatcc 3720

ccgccctgct gttcctctgg acacttggac tgtgtctggc tgcccctaag aaaggggttc 3780

gatggtgtgt catatccaca gcagagtatt caaaatgccg ccagtggcaa tcaaagataa 3840

gaagaactaa tcccatcttc tgcataagga gggcttctcc cactgactgt atccgggcca 3900

tcgcggcaaa aagggcagat gctgtgaccc ttgatggtgg tttggtgttt gaagcaggcc 3960

agtacaaact gcggccggta gcagcggaga tctacgggac agaagagaat ccccaaacct 4020

actattatgc tgtggctgta gtgaagaaag gtttcaactt tcagctgaac cagctacaag 4080

gtcgaaagtc ctgccacaca ggccttggca ggtctgccgg gtggaatatc cctatagggt 4140

tacttcgccg gttcttggac tgggcagggc cacctgagcc cctccagaaa gctgtggcca 4200

aattcttctc tcagagctgt gtgccctgcg cagatggaaa tgcgtatccc aacctgtgtc 4260

agctgtgcat agggaaaggg aaagataaat gtgcttgttc ctcccaggaa ccgtattttg 4320

gctattccgg tgccttcaac tgtctgcaca aagggattgg agatgtggct tttgtcaagg 4380

agagtacagt gtttgagaac ctgccacaga aggctgaccg ggacaaatac gagctactct 4440

gcccagacaa tactcgaaag ccagtggaag cattcaggga gtgccacctt gcccgggtcc 4500

cttctcatgc tgttgtggcc cgaagtgtga atggcaagga gaactccatc tgggagcttc 4560

tctaccagtc acagaaaaag tttggaaaaa gcaatccaca ggagttccag ctctttggct 4620

ctcctggtca gcagaaggac ctcctgttta gagatgctac catcgggttt ttgaagatcc 4680

cctcaaagat agattctaag ctgtacctgg gcctcccgta ccttactgcc atccagggcc 4740

tgagggaaac ggcagcggag gtggaggcgc ggcaggcgaa ggtcgtgtgg tgcgccgtgg 4800

gtccagagga gctgcgcaag tgccggcagt ggagcagcca gagcagccag aacctgaact 4860

gcagcctggc ctccaccacc gaggactgca tcgtccaggt gctgaaagga gaagctgatg 4920

ctatgagctt ggatggagga tttatctaca ctgcgggcaa gtgtggtttg gtgcctgtcc 4980

tggcagagaa ccaaaaatct cgccaaagca gtagctcaga ctgtgtgcat agaccaacac 5040

aagggtattt tgccgtggcg gttgtcagga aagcaaatgg tggtatcacc tggaattctg 5100

tgagaggcac gaagtcctgc cacactgctg tggacaggac agcaggctgg aacatcccca 5160

tgggcctgct tgtcaaccag acaggctcct gcaaatttga cgaattcttt agtcaaagct 5220

gtgctcctgg gtctcagccg ggatccaatc tctgtgcact gtgtgttggc aatgaccagg 5280

gcgtggacaa gtgtgtgccc aacagtaatg agagatacta tggttacacc ggggctttca 5340

ggtgcctggc tgagaatgct ggggatgtgg cgtttgtgaa agatgtcact gtcttggaca 5400

acacgaatgg acagaacaca gaagagtggg ccagggaatt gaggtcagat gactttgagc 5460

tgctgtgcct tgatggcacc aggaagcctg tgactgaggc tcagaactgt cacctggctg 5520

tggcccccag tcatgctgtg gtctctcgga aggaaaaggc agcacaggtg gaacaggtgc 5580

tactcactga gcaggctcag tttggaagat acggaaaaga ctgcccggac aagttttgct 5640

tgttccggtc tgagaccaaa aaccttctgt tcaacgacaa cacggagtgt ctggcccaac 5700

tccaaggcaa aacaacatac gaaaaatatt tgggatcaga gtatgtcaca gccatcgcta 5760

acctgaaaca gtgctcagtc tccccgcttc tggaagcctg tgccttcatg atgaggtaag 5820

gtaccgtaag ttcattttaa tgactgtata ttgatgttct accaaaggaa ataaaagaaa 5880

acttcttaaa gaacatacca taaaaacaga tttagaataa acatgacaaa atcaatatct 5940

agagcgtcat agtagaattt tccaaaatgg gaaattggca ggacgttctg atatctgcag 6000

ctaatgttaa tccactactc aggaacttgt ggagcagcgc tctctgttct ttgagattca 6060

ttctgatgaa gtcaggaaaa agttttctat ccaaagcaaa aacacagtaa tttcatttta 6120

tcctccttac aattttacta atctctaaag gcttttcttt tggttatata tacccatgat 6180

atacattaca attcagtgtg gggaataaag cacagatttt gacatccaaa agtcccaaat 6240

ccaaatcctg accttttttg cttacttaaa ataatgtatt aatgcttatt tttataattc 6300

tgaaggtgat taaagacaat aatctgttaa gcatagtgct gggaagatac atagcagtca 6360

gtttttattg atttagtaaa attgtactgc tgactatctt catcacatga ttttaagaat 6420

ttttgttttt tcagaagaat taagtgaatt ctcaggaact ccacaattat ggcctttggt 6480

aagttggaaa tcatttgtgg aaccatcgat cctcttttcg tttaaagact cattacaaag 6540

ataggactgt agactataaa gatttttttt cctgtagttg agctccttgt ggacacatta 6600

gcacttagat aataattaaa ttggcttgga catttgcaaa tgtttgtttc ataattatac 6660

tatatgtaaa tagcaatcaa attagataat tttaatgaat ataatttatt atattgaacc 6720

cctatacaag tataggagca tgaatgctac taattttcca tcaagatgtg accttgagat 6780

gctggtaaac tcaacagtgg gattctattt tttatgatca ctacaataaa aatccttagc 6840

aagtcatgtg ataaaaccaa gtatttgttt ctcaacaaga aaacagactt taacgtctac 6900

agacttgttt taattaactt catccattgt actggtgttt ccgattgtat gtcagtcgac 6960