一种冷冻保护效果提升的细胞冻存液及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及细胞冻存，尤其涉及一种冷冻保护效果提升的细胞冻存液。

背景技术：

1、细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存液是细胞冻存采用的常用试剂，通常含有dmso。对于含dmso的细胞冷冻液，按照其组分和功能，主要分为三类。第一类是载液，通常为生理盐水、缓冲液或细胞培养基，为冷冻液提供适宜细胞存活的基质环境。第二类是渗透性保护剂dmso，它是冷冻保护剂，避免细胞在低温状态下受到的冷冻损伤。第三类是非渗透性保护剂，例如助悬剂，它能制造粘度，让细胞不容易团聚，从而被dmso均匀地渗透。广泛使用的助悬剂是fbs（胎牛血清），它不仅有粘度，还含有生长因子、激素、蛋白/多肽和能量物质。最经典的细胞冷冻液的构成组分是：某细胞培养基、dmso和fbs。

2、对于载液，由于培养基的成分非常多（＞15种），不同种培养基成分各异，且不同生产商制造的同种培养基原料质量不可控。所以，尽管培养基含有维生素、能量、氨基酸等适宜细胞生存的成分，从质量可控方面来说，不是理想的组分。对于助悬剂，fbs来源于胎牛，且批次间质量不稳定。渐渐地，也有使用药用hsa（人血清白蛋白）替代fbs作为助悬剂。虽然药用hsa质量可追溯、较稳定，但由于hsa来源受限，有法规管控，不适宜长期大量采购和使用。

3、随着生物医药技术的发展，使用者对冻存液的质量也有了更高的要求。需求的趋势是：（1）质量稳定可控，减少原料来源的差异；（2）完全化学成分，减少对动物源/人源材料的依赖，并且避免外源污染物（例如支原体和动物源病毒）的侵入。

4、现有技术公开了不同效果的细胞冻存液。目前已有完全化学成分的冻存液，例如cellbanker 2，由dmso和无机盐溶液组成。该冻存液有较好的冻存效果，但是其为进口试剂，存在价格高昂、供货周期长等问题。专利文献1（cn116897921a，公开日2023-10-20）公开了一种细胞冻存液，包括基础培养基和添加成分，所述添加成分包括的组分及其终浓度为：海藻糖3-8g/ml、i-肌醇3-6mg/ml、乙酰胺4-7v/v％、右旋糖酐6-9v/v％、羟乙基淀粉3-5g/ml、葡萄糖0.5-4g/ml、肝素钠100-150u/ml、二甲基亚砜5-15mg/ml、壳聚糖1-3mg/ml。该冻存液中不含有动物源血清，可避免引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。专利文献2（cn113383768b，公告日2022-07-05）公开了一种肝细胞冻存液，所述冻存液包括以下组分：二甲基亚砜、葡萄糖、人重组白蛋白、维生素c、维生素e、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、细胞缓冲液和氨基酸混合液。该冻存液避免了胎牛血清的使用，减少了对细胞治疗的不良影响，且成本低、成分稳定，制备方法简单，可规模化生产。专利文献3（cn114027294b，公告日2022-11-29）公开了一种免疫细胞冻存液，其组分包括：二甲基亚砜0.02-0.06mg/ml，葫芦素1-6mg/ml，皂荚多糖0.01-0.03ml/ml，香菇多糖1-2mg/ml，聚甘油脂肪酸酯1-5μg/ml，聚乙二醇0.01-0.03mg/ml，非必需氨基酸10-16mg/ml，人血白蛋白12-20mg/ml。该冻存液的复苏细胞存活率可达到95％以上。

5、针对细胞冻存液存在的问题，虽然已公开如上述多种细胞冻存液。但是，本领域仍存在提供更好的防止细胞沉降、复苏细胞复苏率更高、质量更稳定可控、无动物/人源成分的适合多种细胞的冷冻保护效果提升的细胞冻存液。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种冷冻保护效果提升的细胞冻存液，通过对冻存液组分的筛选实验，选择获得包含dmso、羧甲基纤维素钠、脯氨酸的plasmalyte a溶液作为细胞冻存液。在此基础上，进一步优选添加抗凝剂华法林钠组分。本发明还提供了细胞冻存液的制备方法、应用等等。使用本发明的细胞冻存液，获得的复苏细胞复苏率高、细胞形态不变、细胞沉降比例低，且冻存液组分简单、明确、无动物/人源成分，适合工业大规模应用。

2、本发明的一方面提供一种细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液为包含dmso，羧甲基纤维素钠，脯氨酸的plasmalyte a溶液。

3、进一步地，所述冻存液为包含5-10%（v/v）dmso，0.1-0.5%（w/v）羧甲基纤维素钠，0.025-0.2m脯氨酸的plasmalyte a溶液。

4、进一步地，所述冻存液为包含7.5%（v/v）dmso，0.2%（w/v）羧甲基纤维素钠，0.1m脯氨酸的plasmalyte a溶液。

5、进一步地，所述冻存液还包含华法林钠，任选地，所述华法林钠在所述冻存液中的浓度是50-200μg/l。

6、进一步地，所述华法林钠在所述冻存液中的浓度是100μg/l。

7、进一步地，所述冻存液为包含7.5%（v/v）dmso，0.2%（w/v）羧甲基纤维素钠，0.1m脯氨酸，100μg/l华法林钠的plasmalyte a溶液。

8、本发明的另一方面提供所述细胞冻存液的制备方法，其特征在于，称取或量取适量所述细胞冻存液的组分，配制所述细胞冻存液，除菌过滤。

9、本发明的另一方面提供一种细胞冻存方法，其特征在于，包括：

10、（1）配制所述的细胞冻存液；

11、（2）将待冻存细胞与所述细胞冻存液按照适当比例混合，得到待冻存混合物；

12、（3）将所述待冻存混合物进行冻存。

13、本发明的另一方面提供所述细胞冻存液在体外细胞冻存中的应用。

14、进一步地，所述细胞包含间充质干细胞，脂肪干细胞，癌细胞，或免疫细胞。

15、进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，所述癌细胞为hela细胞，所述免疫细胞为nk细胞。

16、本发明的细胞冻存液、制备方法及其应用具有如下有益技术效果：

17、（1）经过创造性地筛选，获得本发明的冻存液包含dmso、羧甲基纤维素钠、脯氨酸、plasmalyte a溶液组分，优选还可以包含华法林钠组分。使用本发明的细胞冻存液，获得的复苏细胞复苏率高、细胞形态不变、细胞沉降比例低，且组分简单、明确、无动物/人源成分，适合工业大规模应用。

18、（2）对冻存液中的氨基酸种类进行筛选，与市售的冻存液cellbanker 2进行比较，赖氨酸的冷冻保护效果差，不适宜用于细胞冻存液，本发明的仅包含脯氨酸的冻存液的冻存效果最好。

19、（3）对冻存液中氨基酸的浓度进行优化筛选，确定100mm氨基酸终浓度是适合用于冻存液的最优浓度。

20、（4）对于短期和长期冻存，含脯氨酸的本发明的3号冻存液均显著优于不含氨基酸的商品cellbanker 2。

21、（5）对冻存液的组分进一步优化，确定抗凝组分华法林钠的添加，更有利于提高冻存细胞的复苏率。使用3号冻存液和16号冻存液的复苏细胞相对于原始细胞，其形态均不变。使用添加抗凝组分华法林钠的16号冻存液的复苏细胞，相对于使用3号冻存液，细胞沉降比例更低。

22、（6）本发明的冻存液，对多种细胞均具有优异的冻存效果，具有普适应，适合工业化应用。本发明的实施例表明，针对脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、hela细胞三种细胞，采用3号冻存液和16号冻存液的复苏率均大于90%。

23、（7）本发明冻存液采用的plasmalyte a成分，具有较好的缓冲能力。羧甲基纤维素钠是化工合成的高分子聚合物，溶于水后形成有粘度的胶体溶液，使细胞助悬于冻存液中，与渗透性dmso和冷冻保护剂均匀地充分接触。通过早期试验，优化了羧甲基纤维素钠最佳工作浓度为0.2% w/v。