一种脂肪间充质干细胞冻存保护液及冻存方法与流程

本发明属于干细胞，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存保护液及冻存方法。

背景技术：

1、间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞可由脐带血、骨髓和脂肪分离而来，具有无限复制潜力和体外分化为中胚层组织成熟细胞的能力。从脂肪组织中获取间充质干细胞是成体干细胞的一种来源途径。

2、脂肪间充质干细胞具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，它在体外增殖快、衰亡率低、分化能力强，脂肪间充质干细胞受到伦理学的限制较小，是移植范畴使用研究远景最大的再生来源干细胞。人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为：成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞，同时也可以向其他胚层分化，脂肪间充质干细胞应用于临床治疗和再生医学的潜能已被干细胞研究者们广泛关注。因此，脂肪间充质干细胞的保存有重要意义。

3、目前，为了延长脂肪间充质干细胞的保存时间，脂肪间充质干细胞多是添加冻存液后在液氮中保存，冻存液中添加二甲亚砜和胎牛血清蛋白来减少冻存过程对细胞造成是损伤，但是，二甲亚砜具有一定的细胞毒性，不利于细胞的恢复。也有采用1，2-丙二醇、甘油替换二甲亚砜添加在冻存液中，但是保存效果不如二甲亚砜，复苏后细胞活性不理想，因此有必要对脂肪间充质干细胞的冻存液进行改进，以提高脂肪间充质干细胞的保存效果。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，不添加dmso和动物血清，冻存效果好。

2、本发明的另一个目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用本发明提供的冻存保护液，操作简便。

3、为了实现上述目的，本发明所采用的第一个技术方案是：

4、一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，包括基础液、营养剂和抗冻剂；所述基础液为：培养基；所述营养剂为：转铁蛋白、亚油酸、胆固醇；所述抗冻剂为：羟乙基淀粉、岩白菜内酯、香叶醇。

5、进一步地，所述培养基为dmem/f12培养基。

6、进一步地，所述营养剂在培养基中的终浓度为：转铁蛋白5.5-10μg/ml、亚油酸0.1-0.5μg/ml、胆固醇1.5-5.5μg/ml。

7、进一步地，所述抗冻剂在培养基中的终浓度为：羟乙基淀粉4.5-8.0μg/ml、岩白菜内酯0.5-1.0μg/ml、香叶醇2.5-7.5μg/ml。

8、为了实现上述目的，本发明所采用的第二个技术方案是：

9、一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存保护液冻存脂肪间充质干细胞。

10、具体的，所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括将脂肪间充质干细胞用冻存保护液重悬后分装至冻存管中，放入程序降温仪进行降温，降温过程如下：以1-2℃/min降温至4℃，然后以15-20℃/min降温至-15℃，再以2-3℃/min降温至-40℃，最后以10-15℃/min降温至-80℃，保存2h后转移至液氮中。

11、优选的，脂肪间充质干细胞在所述冻存保护液中的密度为：1-8×107个/ml。

12、优选的，所述脂肪间充质干细胞为p1-p9代脂肪间充质干细胞。

13、本发明方法具有如下优点：本发明提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，在基础液培养基中添加营养剂和抗冻剂，特别是添加的抗冻剂羟乙基淀粉、岩白菜内酯、香叶醇，能有效降低冻存过程对细胞造成的伤害，提高冻存细胞复苏后的活性，有效保障了冻存后的脂肪间充质干细胞仍能被用于科研或者临床中，本发明的冻存保护液不添加dmso和动物血清，成分安全。

14、本发明还提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，过程简便，易于操作。

1.一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，其特征在于，包括基础液、营养剂和抗冻剂；所述基础液为：培养基；所述营养剂为：转铁蛋白、亚油酸、胆固醇；所述抗冻剂为：羟乙基淀粉、岩白菜内酯、香叶醇。

2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞冻存保护液，其特征在于，所述培养基为dmem/f12培养基。

3.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞冻存保护液，其特征在于，所述营养剂在培养基中的终浓度为：转铁蛋白5.5-10μg/ml、亚油酸0.1-0.5μg/ml、胆固醇1.5-5.5μg/ml。

4.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞冻存保护液，其特征在于，所述抗冻剂在培养基中的终浓度为：羟乙基淀粉4.5-8.0μg/ml、岩白菜内酯0.5-1.0μg/ml、香叶醇2.5-7.5μg/ml。

5.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述冻存保护液冻存脂肪间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括将脂肪间充质干细胞用冻存保护液重悬后分装至冻存管中，放入程序降温仪进行降温，降温过程如下：以1-2℃/min降温至4℃，然后以15-20℃/min降温至-15℃，再以2-3℃/min降温至-40℃，最后以10-15℃/min降温至-80℃，保存2h后转移至液氮中。

7.根据权利要求5所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，脂肪间充质干细胞在所述冻存保护液中的密度为：1-8×107个/ml。

8.根据权利要求5所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞为p1-p9代脂肪间充质干细胞。