一种检测血中gcdcs和gcdca的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析化学和医学领域，是一种快速定量检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCS和GCDCA)的试剂盒，对人血液进行超高效液相色谱质谱联用分析，以快速定量测定血中GCDCS和GCDCA的浓度，用于肝癌的辅助诊断。
背景技术：
肝癌是常见的恶性肿瘤之一在恶性肿瘤死亡率中仅次于胃癌和食道癌而居第三位。肝癌主要和肝炎病毒感染以及肝硬化等疾病相关。肝癌的早期症状经常不明显，多数病人无症状，体检亦缺乏肿瘤本身的体征。因此肝癌发现时，患者大多已进入中晚期，这一阶段肝癌缺乏有效治疗手段。因此，肝癌的早期诊断非常重要，可使肝癌的五年生存率显著性提高。随着分子生物学的不断发展，多种新型标志物不断发现，有望提高肝癌的早期诊断 率，改善治疗效果。目前最常用的临床肝癌血清标志物为甲胎蛋白(AFP)。然而AFP血清水平在诊断肝癌时存在敏感性和特异性较低的缺点，单独用于确诊时的检出率一般只有50% -75%左右，对早期肝癌的诊断率更低。胆汁酸是由肝实质细胞在线粒体中以胆固醇为原料直接合成的存在于胆汁中的一大类胆烷酸的总称。胆汁酸一直被认为仅具有促进脂类的消化和吸收、维持胆汁酸分泌的动态平衡、抑制胆固醇在胆汁中析出沉淀而形成胆结石以及在病毒性肝炎和胆道堵塞等疾病中辅助诊断等生理功能。近年来，胆汁酸越来越引起人们的重视，其被认为是一种多功能的重要信号分子，在能量动态平衡(文献I ffatanabe, M. ；Houten, S. M. ；Mataki,C. ;Christoffolete，M. A. ;Kim，B. W. ;Sato，H. ;Messaddeq，N. ;Harney，J. W. ;Ezaki，0. ;Kodama，T. ;Schoonjans，K. ;Bianco，A. C. ；Auwerx, J. Nature 2006，439，484-489.文献 2:Baxter，J. D. ;Webb，P. Nature 2006，439，402-403.)、磷脂代谢(文献 3:Martin，F. P. J. ；Dumas, M. E. ；Wang, Y. L. ；Legido-Quigley, C. ;Yap，I. K. S. ;Tang，H. R. ;Zirah，S. ;Murphy，G. M. ;Cloarec，0. ;Lindon，J. C. ;Sprenger，N. ;Fay，LB. ;Kochhar，S. ；vanBladeren，P. ;Holmes，E. ;Nicholson，J. K. Molecular Systems Biology 2007，3，16.文献 4 :Bilz，S. ；SamueI, V. ;Morino，K. ；Savage, D. ;Choi，C. S. ；ShuIman, G. I. AmericanJournal of Physiology-Endocrinology and Metabolism 2006，290，E716-E722.)、糖代谢(文献 5 :Nguyen，A. ；Bouscarel B. Cellular Signalling 2008，20，2180-2197.文献 6 Brinton, E. A. Diabetes Obesity&MetaboIism 2008，10，1004-1011.)以及细胞增殖或凋亡(文献 7 :Metalli，V. D. ;Mancino，M. G. ;Mancino，A. ；Torrice, A. ;Gatto，M.；Attili, A. F. ;Alpini，G. ；Alvaro,D.Digestive and Liver Disease 2007，39，654-662 文献 8 :Ramalho，R. M. ；Viana, R. J. S. ；Low, W. C. ；Steer, C. J. ；Rodrigues, C. M. P. Trends inMolecular Medicine 2008，14，54-62.)等整合调节中起重要调节作用。我们通过代谢组学研究，基于超高效液相色谱-质谱分析平台分离检测健康妇女、良性肝病和肝癌病人血清中的代谢物小分子，利用统计学手段分析比对三组人群的代谢差异，发现在血清中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和它的前体甘氨鹅脱氧胆酸的比值跟肝癌有关(专利申请号:201010175559. 5)。目前尚无文献报道高效定量检测人体内的3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的方法。本发明提供了一种用于快速定量检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的试剂盒，该试剂盒对样品无需复杂的预处理过程，而且定量准确、重复性好、稳定性闻。
发明内容
本发明的目的是开发一种快速定量检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的试剂盒。使用该试剂盒检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的方法具有定量准确，重复性好，稳定性高，快速高效的特点；测定一个实际样本只需10分钟，适于大规模临床应用，。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下该试剂盒由三部分构成1)标准对照品-3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸；2)弱洗脱液-pH 4. 0 8. 0的碳酸铵；3)强洗脱液-乙腈或甲醇本试剂盒选用3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸标样做对照品，可准确进行目标化合物定量，不受仪器、环境等外在因素影响；采用IOmM的碳酸铵缓冲液、乙腈体系可以得到最好的分离和灵敏度效果，并达到快速分离分析3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的目的。所述血是指离体的血清或血浆。本发明方法具有的效果是采用3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸标准对照品，可准确进行目标化合定量，不受仪器、环境等外在因素影响；缓冲液选择IOmM的碳酸铵和乙腈体系，可以得到最好的灵敏度和分离效果，可以快速(IOmin)定量检测3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸，可用于肝癌的早期筛查和辅助诊断。
图I标样及实际血清样品分析TIC图。I. 3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸(GOTCS) ；2.甘氨鹅脱氧胆酸(GOTCA)。图2不同缓冲盐(IOmM甲酸铵、乙酸铵、碳酸铵)对样品中G⑶CS，G⑶CA峰检测的影响图3实际血清样品胆汁酸指纹分析TIC图(SM扫描模式，流动相为50mM乙酸铵/乙腈)
具体实施例方式本发明还开发了基于检测试剂盒的使用条件，并在正常对照、肝炎、肝硬化和肝癌样本中进行了应用。具体步骤如下，I)选取试剂盒最佳组成采用3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸标准对照品；色谱分离采用IOmM的碳酸铵缓冲液、乙腈体系(也可选择其他PH值和浓度5-50mM的碳酸铵(甲酸铵、乙酸铵)体系，但这些体系的分析灵敏度较差，也可能延长分析时间)。2)试剂盒使用条件色谱仪器为超高效液相色谱，色谱柱为CS柱，柱温60摄氏度，流速0. 5ml/min(也可选用C18色谱柱,柱温25 60摄氏度,流速0. 2 I. Oml/min的条件来分析，但因这些方法分离速度较慢且未采用)，质谱仪器为三重四极杆质谱。3)在相同条件下取早晨空腹正常人和确诊的肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清，采集后于4°C静置半小时、9000g条件下离心15分钟取上清(血清)后立即储存于_80°C的冰箱中备用。4)取3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸以及甘氨鹅脱氧胆酸标准品，以10%乙腈稀释成标准序列浓度(浓度范围2ng/ml 10 ii g/ml)，以浓度与对应峰面积构建线性方程。
5)血清样品预处理样品待测时室温解冻,取50 U I血清，加入200 U I乙腈，振荡30秒，4°C 14000g条件下离心15分钟后，取200 U I上清液与400 U I高纯水混匀直接上样分析，通过总离子流图计算3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸以及甘氨鹅脱氧胆酸的峰面积，对照标准曲线以确定3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸以及甘氨鹅脱氧胆酸的含量。6)线性相关系数、单针进样重复性、回收率以及日间和日内精密度均符合美国食品与药物管理局(FDA)检验标准。G⑶CS在2. 21ng/ml I. 73ug/ml浓度范围内，线性相关系数0. 9997，G⑶CA在5ng/ml 10ug/ml浓度范围内，线性相关系数0. 9995 ;采用低中高三个浓度回收率在85% 105%之间；同一血样每天平行按上述方法测定7次，连续三天，RSD均小于10%，证明其定量结果准确可靠，重复性好，稳定性高。实施例II.血清样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。正常对照、肝炎、肝硬化和原发性肝癌组纳入标准参考《黄家驷外科学(第7版)》人民卫生出版社2008北京在相同条件下收集206例正常人、确诊的35例肝炎、67例肝硬化和39例肝癌患者的血清，采集后于4°C静置半小时、9000g条件下离心15分钟取上清后立即储存于_80°C的冰箱中备用。2.分析方法2. I血清样本预处理血清样品预处理样品待测时室温解冻，取50 U I血清，加入200 U I乙腈，振荡30秒，4°C 14000g条件下离心15分钟后，取200 u I上清液与400 u I高纯水混匀直接上样分析，通过总离子流图计算3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸以及甘氨鹅脱氧胆酸的峰面积，对照标准曲线以确定3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸以及甘氨鹅脱氧胆酸的含量。2. 2超高效液相色谱质谱高温高速分析(I)液相条件为色谱仪器为Agilent 1290超高效液相色谱，色谱柱为WatersACQUITY UPLC BEH C8柱，流动相A为IOmM碳酸氨溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件为0 0. 5min为体积比75 % A相(其余为B相)，0. 5 3. 5min线性变化至70 % A相，3. 5 6min降至60%,在0. Imin内降至10%,并保持3. 9min,然后升至75% A相并保持I. 5min ;流速0. 5mL/min,柱温60°C，进样量20 u L，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测。
(2)质谱条件为质谱仪器为Agilent6460A三重四极杆质谱，采用电喷雾离子源负离子模式检测；脱溶剂气和锥孔气为高纯氮气流量均为480L/h，温度分别为400°C和350°C，离子源温度为120°C ;毛细管电压和喷口电压分别为3500V和4000V ;多反应监测方法条件见表I。表IG⑶CS、G⑶CA多反应监测分析参数
起始时间母离子子离子驻留时间碎裂电压碰撞能量
GCDCS 0 528.3 448.3 200 20035
GCDCA 4 448.3 74 200 240423.血清测试结果与分析 对上述347例样本进行测定，定量结果如表2所示表2 347例样本测试结果(类内均值及方法)
测试数 GCDCS(UgZml) GCDCA(ug/ml) GCDCS/GCDCA正常-206 — 0. 117±0. 175 ~~0. 633±0. 706 0. 324±0. 288肝炎 350. 351 + 0.477 1.898 + 2.660 0.411 + 0.205
肝硬化 67 1.917±2.302 23.41±35.173 0.299±0.226 非肝;一 308 — 0.535±1.313 ~^751±18.820 0. 328±0.264 肝癌39 0.218±0.250 I. 106±0.806 1.061±2.294对上述G⑶CS/GOTCA结果进行统计学分析，类间单因素分析结果(p值)如表3所示，表明肝癌与其他正常及良性疾病均存在显著性差异，而正常人与良性肝病间不存在显著性差异，预示其可能用于肝癌的辅助诊断。表3不同类别间G⑶CS/GOTCA比值的单因素分析结果(p值)
I正常 I肝炎 I肝硬化非肝癌肝癌
正常I_____
肝炎一 0.36 _ I—
肝硬化 0. 730.25 I
非肝癌 0. 14 ~I. PO ~ 23 ~I
肝癌1.2E-07 0.017 0.0002 1.7E-Q9 I比较例与检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的试剂盒(专利申请号201010175559. 5)相比较，通过对试剂盒及其应用分析条件进行优化，使分析时间更短，灵敏度更高，结果更为准确。I、以串联质谱代替单四级杆质谱，其定量灵敏度提高至少10倍，同时更换了缓冲盐体系，由乙酸铵变成甲酸铵，使GCDCS的检测灵敏度提高了一倍(见图2)；2、由于灵敏度的提高，预处理过程得到简化，原方法采用脱蛋白后冻干、复溶已达到浓缩的目的，需耗时超过6小时，本试剂盒采用脱蛋白后直接稀释进样，仅需0. 5小时，大大缩短了预处理的时间，同时避免了多次转移导致的物质流失，提高定量的准确性。
3、通过分析方法优化，样本色谱分析时间由19分钟(原方法分析谱图见图3)缩减至10分钟，同时对比看出灵敏度获得很大的提高；4、原有试剂盒未提供3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的标准品，直接以相对检测面积进行比较，其结果受仪器、环境等等因素影响，本试剂盒选用3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸标样做对照品，可准确进行目标化合物定量， 不受外在因素影响。
权利要求
1.一种检测血中G⑶CS和G⑶CA的试剂盒，其特征在于该试剂盒由三部分构成(I)标准对照品-3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸；(2)弱洗脱液-pH 4. O 8. O的碳酸铵；(3)强洗脱液-乙腈或甲醇。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于选取的试剂盒采用3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸标准对照品，可准确进行目标化合物定量，不受仪器环境等外在因素影响；试剂盒中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的摩尔比为I : 3-5。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于选取的试剂盒缓冲液为IOmM的碳酸铵、洗脱液为乙腈，可以得到最好的分离和灵敏度效果并达到快速分离分析3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和常规胆汁酸的目的。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于采用试剂盒的检测过程是通过液相色谱-串联质谱联用技术，3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸在负离子检测模式下的离子对的荷质比分别为528. 3/448. 3和448. 3/74。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于色谱分析采用CS超高效液相色谱柱。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于检测过程时，取待测血清样品50-200 iil，加入3-5倍体积乙腈，振荡20-40秒，4_10°C 10000_15000g条件下离心10-15分钟后取上清液，直接用水稀释2-5倍，直接进行液相色谱-串联质谱上样分析。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述血是指离体的血清或血浆。
全文摘要
本发明公开了一种检测血中GCDCS和GCDCA的试剂盒，该试剂盒由3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸标准对照品、碳酸酸铵缓冲液和乙腈组成。使用该试剂盒检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的方法具有检测成本低，定量准确，重复性好，稳定性高，快速高效的特点；测定一个实际样本只需10分钟，可适于临床应用。
文档编号G01N30/02GK102798672SQ20111013233
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月21日 优先权日2011年5月21日
发明者孔宏伟, 王晓琳, 赵欣捷, 王文昭, 许国旺 申请人:中国科学院大连化学物理研究所
文档序号 :
【 6010399 】
技术研发人员：孔宏伟,王晓琳,赵欣捷,王文昭,许国旺
技术所有人：中国科学院大连化学物理研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：孔宏伟,王晓琳,赵欣捷,王文昭,许国旺
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