一种检测食管癌血清蛋白指纹的新方法
技术领域：
本发明涉及一种检测食管癌血清蛋白指纹的方法，使用该方法可确定食管癌血清蛋白质指纹标准的灵敏度、特异性指标，对食管癌的早期发现、早期诊断和早期治疗提供有益的帮助。
背景技术：
随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划规模空前、速度惊人的推进，科学家现在已经把关注的焦点转移到了人类蛋白质组(proteome)——人体组织和细胞制造的各种各样的蛋白质。虽然人类基因组包含了我们身体的全部遗传信息，但那也只是制造蛋白质的原材料，而构成细胞并发挥各种功能则是由蛋白质来完成的。蛋白质也是机体各种不同类型细胞之间差异的决定因素，尽管所有的细胞都拥有同样的基因组，但在不同的细胞内会有不同的基因处在活跃状态，从而合成不同的蛋白质。同样，病变细胞和正常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白质的不同来决定的。
在各大公司和学术界的科学家正试图列出所有的蛋白质种类，并揭示他们之间相互作用的关系。实现这个目的并非易事，研究蛋白质要比研究基因困难得多，生物技术公司都在全力开发最好的技术和实验仪器，这方面的竞争已经全面展开。同时，各国政府的科研计划也在为学术界提供经费，支持对癌细胞、血清和其它液体成份蛋白质组的研究。其最终目的是揭示包括癌症在内的人类各种疾病的特征性蛋白及其组成，即具有疾病特征的“蛋白质指纹”(biomarkerpatterns)，进而发明疗效更高、副作用更小的新药。
近年来，美国Ciphergen Biosystems公司创建了一种蛋白质芯片(ProteinChip)技术，它不仅克服了某些传统蛋白质组分析技术的局限性，集分离与质谱仪于一身，从小量血液、尿液的体液样本和组织、细胞裂解物等粗提样品中，不经纯化高效、快速和准确地直接分析差异蛋白质。伴随着这一技术的出现，形成了一种以分析疾病相关的特殊蛋白质指纹为基础的蛋白组组成模式(pattern)的疾病辅助诊断和预后疗效判断的新思路。
食管癌是危害我国人民健康的常见肿瘤，世界上70％以上的食管癌发生在我国，1995年部分地区统计资料显示食管癌致死占恶性肿瘤死因的第四位。大部分食管癌患者确诊时已属中晚期，以手术为主治疗后的五年生存率一直徘徊在25-30％。但是，早期食管癌手术治疗后，五年生存率可达80％以上。因此，早诊早治是目前改善食管癌患者长期生存的最佳途径。显然，如果能够找到一些在影像学方法检查出食管占位性病变之前就能发现早期食管癌的血清蛋白标志物，对于食管癌的治疗、延长患者术后生存期具有重要意义。
肿瘤的发生发展是正常细胞经过多基因、多步骤的变化，逐渐演变成具有恶性增殖特性的癌细胞并不断转移播散的过程。肿瘤细胞与增殖、凋亡、分化和转移相关的多种基因的表达都发生了改变，变化最终表现为细胞内各种蛋白质的表达和功能改变，从而影响细胞的生命活动。在癌变过程中发生改变的蛋白质和小肽可以经肿瘤细胞代谢、分泌释放到血液或其它体液中。因此，通过研究食管癌血清蛋白质组的改变，有可能发现与食管癌相关或特异的蛋白质或肽类物质，即食管癌血清蛋白标志物。目前可用于食管癌辅助诊断、疗效评价和术后随访的血清标志物主要包括癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌相关抗原(SCC)、细胞角化素蛋白片段19(CYFRA21-1)、p53蛋白抗体(p53-Ab)等，虽具有一定的临床应用价值，但敏感性低、特异性差。因此，寻找早期诊断、无创性、高敏感度、高特异性的新的食管癌相关的特异血清标志“蛋白指纹”具有重要临床意义。
发明内容
本发明的目的是提出一种检测食管癌血清蛋白指纹的方法，使用该方法从血清标本中寻找一组(若干个)差异表达的食管癌相关的特异蛋白质/小分子肽，并利用Biomarker Patterns Software软件分析建立最佳的树状分类模型，达到区分食管癌患者与非肿瘤健康人、区分食管癌与食管良性病变、区分食管癌与人体其它消化道肿瘤、以及早期发现食管癌的目标。
本发明的目的是这样实现的一种检测食管癌血清蛋白指纹的新方法，其步骤是采集食管癌组血清标本、对照组血清标本、早期食管癌组血清标本、食管良性疾病组血清标本及其它恶性肿瘤组血清标本；所述血清标本在离体后2-3小时内于4℃温度下进行离心，分离血清后分装保存备用，保存温度为-80℃；将所述血清标本置于弱阳离子亲和吸附类的蛋白质芯片上进行特异性结合与洗脱处理；将所述经过处理的芯片置入蛋白质芯片阅读器(串联质谱仪)分析，获得血清标本蛋白质组图谱；使用蛋白质芯片数据采集软件采集数据，对比分析食管癌组和对照组血清标本的蛋白质组图谱，结合使用蛋白质指纹树状模型分析软件获得一组食管癌组与对照组的差异蛋白质图谱即蛋白质指纹，并以该蛋白质指纹为判断标准进行盲筛试验；采用盲法对其余血清标本进行筛选试验，确定食管癌血清蛋白质指纹标准的灵敏度、特异性指标。
本发明提出了一种灵敏度高、特异性强、无创性、快速、小标本量和高通量的检测方法，使用本发明的食管癌血清蛋白指纹能够对食管癌进行早期检测，其敏感性和特异性均达到80％以上，为食管癌的早期发现、早期治疗和对高危人群的预防提供了新的方法，使食管癌的早期发现、早期诊断和早期治疗成为可能。
以下结合附图对本发明的实施例及积极效果作进一步说明。
图1是蛋白质3975.4的胶带形2是蛋白质3975.4的峰形3是蛋白质2047.8的峰形4是线性组合分析模型ESCC-WCX2-1示意图具体实施方式
实施例一一种检测食管癌血清蛋白指纹的方法，其步骤如下采集食管癌组血清标本、对照组血清标本、早期食管癌组血清标本、食管良性疾病组血清标本及其它恶性肿瘤组血清标本；其中，食管癌组为临床病理确诊为食管癌的单纯手术治疗病例，共199例；对照组为年龄、性别匹配的非肿瘤健康志愿者，共106例；早期食管癌组为食管早期癌微小病变(原位癌)病例，共14例；食管良性疾病组为食管炎、返流性食管炎、食管平滑肌瘤等病例，共10例；其它恶性肿瘤组为消化系统其它恶性肿瘤病例，共30例。
在本实施例中，被采集者清晨空腹静脉采集全血3ml(毫升)，在离体后2-3小时内于4℃温度下进行离心，分离血清后分装保存备用，保存温度为-80℃。
将所述血清标本置于弱阳离子亲和吸附类的蛋白质芯片上进行特异性结合与洗脱处理；经处理后，该芯片成为结合了特定类型蛋白质的芯片。
将所述经过处理的芯片置入蛋白质芯片阅读器(串联质谱仪)分析，获得血清标本蛋白质组图谱。
使用蛋白质芯片数据采集软件采集数据，对比分析食管癌组和对照组血清标本的蛋白质组图谱，结合使用蛋白质指纹树状模型分析软件获得一组食管癌组与对照组的差异蛋白质图谱即蛋白质指纹，并以该蛋白质指纹为判断标准进行盲筛试验。
采用盲法对其余血清标本进行筛选试验，确定食管癌血清蛋白质指纹标准的灵敏度、特异性指标。
实施例二一种检测食管癌血清蛋白指纹的新方法，其步骤如下采集食管癌组血清标本、对照组血清标本、早期食管癌组血清标本、食管良性疾病组血清标本及其它恶性肿瘤组血清标本。
其中，食管癌组为临床病理确诊为食管癌的单纯手术治疗病例，共199例；对照组为年龄、性别匹配的非肿瘤健康志愿者，共106例；早期食管癌组为食管早期癌微小病变病例，共14例；食管良性疾病组为食管炎、返流性食管炎、食管平滑肌瘤等病例，共10例；其它恶性肿瘤组为消化系统其它恶性肿瘤病例，共30例。
在本实施例中，被采集者清晨空腹静脉采集全血3ml，在离体后2-3小时内于4℃温度下进行离心，分离血清后分装保存备用，保存温度为-80℃。
将所述血清标本置于弱阳离子亲和吸附类的蛋白质芯片上进行特异性结合与洗脱处理；所用蛋白质芯片为美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.出品。
在本实施例中，所述芯片装入特定的加样器(Bioprocessor)中，每个加样点上加200μl(微升)结合缓冲液(50mM醋酸钠，pH 4.0，Sigma公司产品)，摇床孵育5分钟后弃去结合缓冲液。重复此过程一次。弃去孔中的液体，备用。
所述血清标本需经稀释处理，该稀释处理的步骤是血清标本先经蛋白浓度定量，(Micro BCA Protein Assay Kit，PIERCE公司产品)。
将3μl血清和6μl样本稀释液U9(9M Urea、2％CHAPS、50mM Tris-HCl、pH9.0和1％DTT)混合，置于冰上30分钟，每隔5分钟轻微混匀一次。在上述稀释血清中加入108μl结合缓冲液，混匀后置于冰上。
所述特异性结合与洗脱处理的步骤是在所述蛋白质芯片的每个加样孔中加入100μl稀释的血清，盖上锡纸，室温下在摇床上孵育1小时。
弃去血清样品，每个加样孔中加入200μl结合缓冲液，摇床上洗5分钟；弃去结合缓冲液，重复此步骤两次；弃去结合缓冲液，每个加样孔中加入200μl HPLC级纯净水(Millipore公司产品)，轻摇后立即弃去水，从加样器上卸下所述芯片，该芯片在室温下自然干燥。
加能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules，EAM)取出所述芯片待微干后，在每个加样孔上加0.5μl饱和SPA(50％乙腈(V/V)、0.5％三氟乙酸(V/V)，Sigma公司产品)，SPA(Sinapinic acid，EAM的一种，Ciphergen公司产品)。
将芯片放入芯片阅读器(PBS II-C)，可以检测到结合到芯片上的所有蛋白质，通过蛋白质芯片数据采集软件(ProteinChip@Software)读取数据，得到每一个加样点上的所有的蛋白质图谱。仪器的主要参数设置如下检测分子量范围0-50,000道尔顿；激光强度175；检测敏感度8；检测点24-84区(即，对芯片每点上结合蛋白恒定的激光轰击范围，两相邻激光激发位置间隔5个区，覆盖每点中央60％的最佳蛋白结合区域)。
血清蛋白质组图谱的初步分析利用蛋白质芯片系统专用软件Ciphergen Proteinchip Software(Ciphergen公司)对已经整合的所有数据进行初步处理，选择其中的一些参数，如调整基线(baseline)，并将所有的蛋白质图谱标准化到相同的总的粒子流(totalioncurrent)，再用Biomarker Wizard软件检测数据对已经得到的蛋白质图谱进行分析(选择信噪比S/N参数为5最小峰参数为20％)，系统共探测到一百多个蛋白质峰，经过T检测得到49个P＜0.05的蛋白质峰。
食管癌患者血清差异表达蛋白质峰的获得使用Biomarker Patterns Software高级树状模型分析软件处理已经初步得到的蛋白质的数据，选择特定的参数配置，通过对59例食管癌和61例正常对照的分析，寻找出最佳的分析模型(命名为线性组合分析模型ESCC-WCX2-1)。食管癌血清蛋白指纹由12个不同质荷比(M/Z)的蛋白质组成。在这种分析模型中得到12个在食管癌组和对照组中具有差异表达的蛋白质峰，并联合应用这12种蛋白质的差异可以有效地区分食管癌和非肿瘤正常对照组。这12种蛋白质的线性组合系数和分子量分别为+0.278(1028.35Da)；-0.268(1098.97Da)；-0.239(1301.71Da)；-0.235(2047.86Da)；+0.0693(2742.74Da)；-0.328(4130.07Da)；+0.308(3975.46Da)；+0.0912(4283.96Da)；-0.409(4301.17Da)；+0.153(5635.14Da)；+0.293(6203.80Da)；和+0.496(13749.1Da)。在对这两组共计120例标本的分析中，检测的灵敏度为91.53％，特异性为86.89％。
线性组合分析模型ESCC-WCX2-1的盲筛应用进一步选用了3组共195例血清标本，其中包括食管癌血清140例、非肿瘤正常对照血清45例和食管良性病变血清10例。
采用相同的实验操作条件，相同的软件处理参数，得到的蛋白质图谱应用Biomarker Patterns Software高级线性组合模型分析软件的盲筛功能进行筛选，观察运用该线性组合分析模型ESCC-WCX2-1判断的灵敏度、特异性等指标。实验者在检测时不知道这些标本的临床诊断信息。
检测结果参见图1、图2、图3、图4，其中，
图1显示了蛋白质3975.4的在蛋白质图谱中的表达，对照中的表达要高于肿瘤的表达。标记的为该蛋白质的分子量的大小。
图2显示了蛋白质3975.4的在蛋白质图谱中的另一种表达，对照中的表达要高于肿瘤的表达。标记的为该蛋白质的分子量的大小。
图3显示了蛋白质2047.8在蛋白质图谱中的表达，肿瘤中的表达要高于对照的表达。标记的为该蛋白质的分子量的大小。
使用该线性组合分析模型ESCC-WCX2-1检测这195例标本得到的灵敏度为85％，特异性可达到84.44％。
与食管其它良性肿瘤的关系选择10例食管其它良性疾病对照，线性组合分析模型ESCC-WCX2-1可以将之与食管癌区分开来。
与早期食管癌(原位癌)的关系选择14例早期食管癌(原位癌)微小病变血清，线性组合分析模型ESCC-WCX2-1可以将12例区分为食管癌，准确率为85.71％(12/14)。
与消化系统其它恶性肿瘤的关系选择22例消化系统其它恶性肿瘤血清，线性组合分析模型ESCC-WCX2-1可以将1例区分为食管癌，准确率为95.45％(1/22)。
权利要求
1.一种检测食管癌血清蛋白指纹的新方法，其特征在于采集食管癌组血清标本、对照组血清标本、早期食管癌组血清标本、食管良性疾病组血清标本及其它恶性肿瘤组血清标本；所述血清标本在离体后2-3小时内于4℃温度下进行离心，分离血清后分装保存备用，保存温度为-80℃；将所述血清标本置于弱阳离子亲和吸附类的蛋白质芯片上进行特异性结合与洗脱处理；将所述经过处理的芯片置入蛋白质芯片阅读器(串联质谱仪)分析，获得血清标本蛋白质组图谱；使用蛋白质芯片数据采集软件采集数据，对比分析食管癌组和对照组血清标本的蛋白质组图谱，结合使用蛋白质指纹树状模型分析软件获得一组食管癌组与对照组的差异蛋白质图谱即蛋白质指纹，并以该蛋白质指纹为判断标准进行盲筛试验；采用盲法对其余血清标本进行筛选试验，确定食管癌血清蛋白质指纹标准的灵敏度、特异性指标。
2.根据权利要求1所述的检测食管癌血清蛋白指纹的方法，其步骤如下法，其特征在于所述血清标本为清晨空腹静脉血清；所述血清标本需经稀释处理，该稀释处理的步骤是血清标本先经蛋白浓度定量，将3μl血清和6μl样本稀释液U9混合，置于冰上30分钟，每隔5分钟轻微混匀一次。在上述稀释血清中加入108μl结合缓冲液，混匀后置于冰上；所述特异性结合与洗脱处理的步骤是在所述蛋白质芯片的每个加样孔中加入100μl稀释的血清，盖上锡纸，室温下在摇床上孵育1小时；弃去血清样品，每个加样孔中加入200μl结合缓冲液，摇床上洗5分钟；弃去结合缓冲液，重复此步骤两次；弃去结合缓冲液，每个加样孔中加入200μl纯净水，轻摇后立即弃去水，从加样器上卸下所述芯片，该芯片在室温下自然干燥；取出所述芯片后，待微干后，在每个加样孔上加0.5μl饱和SPA，芯片自然干燥后重复此步骤一次。
全文摘要
本发明涉及一种检测食管癌血清蛋白指纹的方法。该蛋白指纹由采集人血清、血清与弱阳离子亲和蛋白芯片结合、用质谱仪读取血清蛋白图谱、以及用蛋白质指纹分析软件对质谱数据的分析而获得。食管癌血清蛋白指纹由12个不同质荷比(M/Z)的蛋白质组成。本发明提供的食管癌血清蛋白指纹能够对食管癌进行早期检测，其敏感性和特异性均达到80％以上，为食管癌的早期发现、早期治疗和对高危人群的预防提供了新的方法。
文档编号G01N30/00GK1673734SQ20041000629
公开日2005年9月28日 申请日期2004年3月23日 优先权日2004年3月23日
发明者赵晓航, 许洋, 毛友生 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
文档序号 :
【 5931827 】
技术研发人员：赵晓航,许洋,毛友生
技术所有人：中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：赵晓航,许洋,毛友生
技术所有人：中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所
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