Sars病毒特异性免疫核糖核酸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种SARS病毒特异性免疫核糖核酸及其制备方法，更具体地讲，本发明涉及一种以灭活的SARS病毒为抗原制得的SARS病毒特异性免疫核糖核酸及其制备方法。
背景技术：
SARS病毒是在去年我国乃至世界范围内肆虐的SARS病的元凶。它的传播严重影响了人们的正常生活秩序。SARS病毒是一种崭新的冠状病毒，非某种已知冠状病毒的近期变种。冠状病毒是一种RNA病毒。2003年3月以来，国内外相继报道了引起SARS冠状病毒的基因序列，该病毒含有完整的5’末端序列、编码序列和3’末端序列，全RNA基因组长度为29727核苷酸，基因编码区的组成结构与其他冠状病毒类似，包括多个开放阅读框架(ORFS)，分别编码病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和结构蛋白。
特异性免疫核糖核酸(immune RNA，iRNA)从被某种抗原致敏的动物脾脏和淋巴结提取的含有大量核酸的物质，能将抗原刺激的动物对抗原的免疫反应性传递给正常动物。iRNA制品实际上是一种总RNA，其中的免疫活性成分只占极小部分。RNA早期研究工作所用的原材料都是脾脏和淋巴结，但后来一些人的研究证明来自肝脏的RNA亦有传递特异免疫功能的作用，并认为肝脏中有许多细胞如枯否细胞等在免疫中具有一定作用。
国内研究人员不仅用大量实验证明iRNA能传递抗肿瘤和抗HbsAg的免疫反应性，并进行了大量的临床试用研究；而且已有研究人员对治疗动物的传染病尤其是犬类的病毒性疾病(如犬细小病毒和犬瘟热病毒)、羔羊的B型魏氏梭菌感染等进行了研究。结果证明iRNA对这些疾病的治疗起到了积极的作用，取得了明显的疗效。
目前，特异性免疫核糖核酸主要从经特异性抗原免疫的动物肝、脾、淋巴节等组织中提取。关于特异性免疫核糖核酸的提取技术工艺和鉴定标准国内已经标准化，有固定的步骤和方法可以遵循。特异性免疫核糖核酸的提取技术工艺已用于制备抗肿瘤、抗乙肝等药物。但是由于使用的抗原不同，免疫动物的基本方法因抗原不同就各有不同，并且从而获得的产品虽然物理、化学特性相似，但用途和功能完全不同。
我国专利申请03125171.4公开了一组抑制SARS病毒感染的小的单链或双链RNA分子及其作用靶标以及该RNA分子在抑制SARS病毒及与SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染中的应用。
至今，人们仍未有一种能有效地治疗SARS的药物。明年SARS病毒有可能会卷土重来，威胁人类的健康。因此，研究有效治疗和预防SARS的药物的任务迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种治疗SARS病毒的特异性免疫核糖核酸的制备方法。
在本发明的制备SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法中包括如下步骤(1)对SARS病毒进行灭活，制得灭活的SARS病毒；(2)用灭活的SARS病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；(3)从免疫后的动物的组织中提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸；(4)将提取的SARS病毒特异性免疫核糖核酸进行精制、纯化和分装。
上述制备方法是基于下面的原理灭活的SARS和流感病毒中的抗原成分可以诱导和刺激动物产生免疫反应，激活体内免疫活性细胞等，使这些细胞产生特异性的基因转录物——免疫核糖核酸，这种免疫核糖核酸对SARS和流感有特异性治疗作用。同时，免疫核糖核酸也可以刺激人体免疫功能，非特异性地提高人体的抗病能力的。
本发明的发明人根据这一原理，利用在广州分离获得的SARS病毒，经灭活后制成灭活疫苗，然后与可以加强免疫刺激效应的佐剂一起注射到猪等动物体内，诱发动物产生特异性的免疫反应，在证实其产生免疫反应后，提取肝、脾、淋巴节等组织中的免疫核糖核酸，得到了这种治疗SARS和流感的有效药物。
在上述制备方法的步骤(1)之前，还可以包括对SARS病毒进行扩增的步骤。
在步骤(1)中，采用的灭活方法可以是甲醛灭活方法，或者是温度灭活方法。灭活之后要进行检测，以确保灭活的SARS病毒无致病能力。灭活条件的控制关键在于控制灭活温度、时间以及甲醛浓度。
如果选用甲醛进行灭活，则甲醛的浓度可以控制在0.10％-1.00％的范围内，优选为0.15％-0.60％的甲醛，灭活的时间为数小时至数十小时。例如，采用0.2％的甲醛灭活SARS病毒24小时以上，或者0.4％的甲醛灭活SARS病毒2小时以上，都可以使SARS病毒丧失感染性，灭活率为100％，而病毒灭活前后抗原性不受影响。尽管0.2％的甲醛作用24小时以上可以灭活病毒，但能检测出高拷贝的核酸，因此更优选采用0.4％的甲醛灭活24小时作为灭活SARS疫苗的条件。这种灭活方法能有效地灭活病毒，并且灭活前后抗原性不受影响。
如果选用温度灭活，则灭活温度一般控制在46-66℃范围内，灭活时间一般控制在10-100分钟范围内。温度灭活可以在水浴中进行。
在步骤(2)中用灭活的SARS病毒免疫动物时，为加强免疫效果和获得高含量抗体，优选将免疫佐剂和灭活的SARS病毒混合后肌肉注射到动物体内。其中，免疫的动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴或马，优选为猪。
免疫的方法既可以是单独用灭活的SARS病毒(SARS灭活疫苗)免疫动物，也可以采用SARS灭活疫苗与流感疫苗联合对动物进行免疫。为了特异性地提高人体对SARS病毒和流感病毒的免疫功能，优选采用SARS灭活疫苗与流感疫苗联合对动物进行免疫，更优选将免疫佐剂和SARS灭活疫苗与流感疫苗混合后肌注到动物体内。
本发明所使用的免疫佐剂可以是如下物质中的一种或几种佛氏佐剂(Freund’s adjuvant，包括佛氏完全佐剂(FCA)和佛氏不完全佐剂(FIA))、氢氧化铝和CpG，优选为佛氏完全佐剂或佛氏不完全佐剂，更优选为佛氏完全佐剂和佛氏不完全佐剂。
免疫动物(接种)时可以是单次注射，也可以是多次注射。由于一般要多次注射才能达到高免疫状态，所以优选为多次注射。接种方法优选为背部多点肌肉注射。选择合适的免疫的时间间隔和长度可以达到较好的免疫效果。一般需要数天的时间。优选为0天、15天、21天、40天进行接种。
在本发明的步骤(3)中，可以采集动物的肝、脾、淋巴节等组织，按现有技术的方法破碎细胞，使其有效成分释放出来，然后提取分离出特异性免疫核糖核酸。细胞破碎的方法可以采用组织捣碎机捣碎、超声波破碎等，但是常用组织捣碎机捣碎，制成匀浆。
提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法可以为溶剂溶解提取法。溶剂溶解的提取方法常用碱性缓冲液——冷酚法，该方法的原理是先将核糖核酸溶解，然后进行沉淀，最后洗涤、离心。该碱性缓冲液可以是Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选为Tris/HCl缓冲液。所用的酚可采用酚的饱和溶液，这样可达到充分溶解核糖核酸的效果。
在步骤(4)中，将提取的SARS病毒特异性免疫核糖核酸进行精制、纯化和分装时，可以采用现有技术中微孔滤膜过滤、超滤、透析等方法进行精制和纯化，然后在无菌条件下进行分装。
实际上，在分装之前，可以利用核酸测定法检测浓度，利用生物活性法测定其特异性和作用。
另一方面，本发明还提供了一种按照上述方法所制备的SARS病毒特异性免疫核糖核酸，这种SARS病毒特异性免疫核糖核酸既可以是以灭活的SARS病毒为抗原制得的，对SARS病毒有特异性，从而能够有效地治疗SARS，也可以是以灭活的SARS病毒和灭活的流感病毒为抗原制得的，对SARS病毒和流感病毒都有特异性，从而能够对SARS和流感均起到有效的治疗效果。所制得的SARS特异性免疫核糖核酸符合国家生物制品标准，对人体几乎无毒副作用。
本发明用灭活SARS病毒和流感病毒灭活疫苗免疫动物，使动物产生针对SARS病毒的特异性免疫核糖核酸。所制得的特异性免疫的核糖核酸对提升人体抗SARS病毒感染的能力具有明显效果，对SARS和流感治疗都有特异治疗作用，对人体无毒副作用的优点，填补了SARS治疗无有效和特异药物的国内外空白，对防治SARS有特殊意义。
具体实施例方式
下列实施例中所使用的材料为1、流感疫苗上海生物制品厂生产；2、佐剂佛氏完全佐剂和佛氏不完全佐剂，Sigma产品。
3、HRP标记兔抗猪IgG和IgM酶标抗体，美国产品。
4、超滤器美国Millipore公司产品。
实施例1 SARS灭活疫苗的制备在底面积为275cm2细胞瓶内培养VeroE6(中国国家病毒研究所)，待细胞长成致密单层后，用无血清培养液洗细胞3次，加入100ml无血清培养液，分别接种F69和Z2-Z3SARS-Cov病毒株，细胞病变至75％-100％时，滴定病毒，TCID50为log10×107/ml。将培养瓶置-20℃冰箱冻融3次，摇匀置2-8℃冰箱过夜，用0.4％甲醛灭活24hr后，5000rpm×30min，弃去沉淀，上清作为SARS灭活疫苗。
实施例2 用SARS灭活疫苗单独免疫用实施例1制备的SARS灭活疫苗(TCID50Log107/ml)对15头健康去势公猪(体重50Kg，广州市良种猪场)进行免疫，共4次，第1次为佛氏完全佐剂+SARS灭活疫苗；第2次为佛氏不完全佐剂+SARS灭活疫苗，第3次和第4次为单纯SARS灭活疫苗免疫；剂量3×TCID50；接种方法为背部多点肌肉注射。免疫的时间间隔为0d、15d、21d、40d。从耳静脉采集全血1-3ml，血清采集的时间间隔为0d、5d、7d、10d、15d、21d、28d、35d和42d。然后离心分离血清，-20℃保存备用。
实施例3 用SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫联合免疫用实施例1制备的SARS灭活疫苗+流感疫苗对13头健康去势公猪(体重50Kg，广州市良种猪场)进行免疫，共4次，第1次为佛氏完全佐剂+SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫；第2次佛氏不完全佐剂+SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫，第3次和第4次为SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫。剂量SARS为3×TCID50；流感病毒第1次为3人份/猪，以后3次为1人份/猪；接种方法背部多点肌肉注射。免疫的时间间隔为0d、15d、21d、40d。从耳静脉采集全血1-3ml，血清采集的时间间隔为0d、5d、7d、10d、15d、21d、28d、35d和42d。然后离心分离血清，-20℃保存备用。
实施例4免疫效果的检验对实施例2和3得到的免疫血清进行检验。
一.中和抗体检测按照灭活疫苗免疫效果评价检测的方法进行。
1.病毒稀释 将滴定后的病毒稀释成100TCID50/25ul。
2.动物血清 SARS病毒免疫接种猪不同时期的血清，将血清在无菌的96孔板上从1∶10开始，连续倍稀释至1∶10240，每一稀释度2孔，同时采集免疫接种前的各种动物作为对照用。
3.中和试验 在以上血清稀释孔内加入25ul 100TCID50/25ul的Z2-Y3病毒应用液，轻轻摇匀后置36℃ 5％CO2培养箱培养，同时设正常细胞对照与病毒滴度回滴实验。
4.结果的观察 从第4天起观察结果，第7天(细胞100％出现病变)判定结果。
IgG和IgM按照生产商的试剂盒说明书进行。
结果表明两组实验猪均在第5天检测到抗SARS病毒的中和抗体，第4次免疫接种后，其中和抗体效价达到1∶240，符合免疫核糖核酸制备的要求。
二.IgG检测采用间接ELISA法(1)用Ph9.6的碳酸缓冲液将SARS灭活疫苗1∶100稀释后包被96
孔板，4℃过夜；(2)以15％小牛血清PBST(1‰吐温)进行封闭；(3)样本血清用含5％小牛血清PBST稀释100倍后加样；(4)加HRP标记的单抗鼠IgG抗体；(5)加邻苯二胺底物液及H2O2，避光显色；(6)用2M的H2SO4终止反应；(7)用Bio-Rad505酶标仪测各孔490nm的吸光值。
经过检测，结果表明用按实施例2和3的方法免疫猪，均能产生较高的保护抗体(中和抗体)。
实施例4 特异性免疫核糖核酸的提取对实施例2和3得到免疫猪提取特异性免疫核糖核酸。采用碱性缓冲液--冷酚法进行提取。提取猪肝RNA取免疫新鲜猪肝脏(或正常猪肝)，剔除结缔组织及脂肪，切碎，生理盐水漂洗，加3倍体积Tris/HCl缓冲液，高速(12000rpm)匀浆1min，倒出，立即加等体积饱和酚，再高速(8000rpm)匀浆20s，4℃6000rpm离心15min，收集上清并加半量体积饱和酚，冰浴上充分搅拌30min，离心取上清，重复上述操作4～5次至中间无白色界面为止，上清液加乙酸钾至2％浓度后，加3倍体积冷乙醇，置-20℃过夜，次日6000rpm、4℃离心15min，收集核酸沉淀，再用-20℃乙醇∶生理盐水(3∶1)洗涤，4℃6000rpm、离心10min，洗涤4次，所得核酸沉淀，溶于约等于原组织体积的生理盐水中，4℃过夜，用751 GW分光光度计分别测260、280nm处光密度(OD)值，并计算得出RNA含量RNA浓度＝OD2600.022×稀释度÷1000＝mgRNA/ml。
权利要求
1.一种制备SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法，该方法包括如下步骤(1)对SARS病毒进行灭活，制得灭活的SARS病毒；(2)用灭活的SARS病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；(3)从免疫后的动物的组织中提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸；(4)将提取的SARS病毒特异性免疫核糖核酸进行精制、纯化和分装。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用的灭活方法是甲醛灭活或温度灭活。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用甲醛灭活时甲醛的浓度为0.10％-1.00％。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用温度灭活时温度控制在46-66℃范围，时间控制在10-100分钟内。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，除了灭活的SARS病毒和免疫佐剂之外，还采用流感病毒的灭活疫苗一起进行混合后，来联合免疫动物。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的免疫佐剂是佛氏完全佐剂和/或佛氏不完全佐剂。
7.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采集免疫后动物的肝、脾和/或淋巴结组织，将其细胞破碎，然后提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，提取SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法为溶剂溶解提取法。
9.一种按前述权利要求之一所述方法制备的SARS病毒特异性免疫核糖核酸，其特征在于，该SARS病毒特异性免疫核糖核酸是以灭活的SARS病毒为抗原制得的。
10.如权利要求9所述的SARS病毒特异性免疫核糖核酸，其特征在于，该SARS病毒特异性免疫核糖核酸是以灭活的SARS病毒和灭活的流感病毒为抗原制得的。
全文摘要
本发明涉及一种制备SARS病毒特异性免疫核糖核酸的方法，该抗SARS病毒高免血清是以灭活的SARS病毒为抗原制得的，该方法包括以下步骤SARS病毒的灭活、用灭活的SARS病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内，提取特异性免疫核糖核酸、特异性免疫核糖核酸的精制、纯化。本发明还涉及一种由该方法制备的SARS病毒特异性免疫核糖核酸，该抗SARS病毒特异性转移因子是以灭活的SARS病毒和流感病毒灭活疫苗联合为抗原制得的，它对SARS病毒和流感病毒都有特异性，从而能够对SARS和流感均起到有效的治疗效果。
文档编号A61K39/215GK1546515SQ20031011237
公开日2004年11月17日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者陆家海, 王一飞, 潘兴华 申请人:陆家海
文档序号 :
【 972478 】
技术研发人员：陆家海、王一飞、潘兴华
技术所有人：陆家海
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：陆家海、王一飞、潘兴华
技术所有人：陆家海
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除