积雪苷在制备预防或治疗肾脏纤维化的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及积雪苷积在制药中的应用，尤其涉及积雪苷在制备预防或治疗肾脏纤维化的药物中的应用。
背景技术：
积雪草是一种植物药，积雪苷是从积雪草中提取的物质，也称为积雪甙(Asiaticoside)，化学结构见式I。
式I研究发现积雪苷外用抗皮肤粘膜损伤后，具有纤维疤痕过增生作用，该化合物作为相关用途的化妆品和药品均有上市，在这些产品中积雪苷是其主要活性成份。
发明内容
本发明的目的是提供积雪苷在制备预防或治疗肾脏纤维化的药物中的应用。
所述的肾脏可以为肾间质和/或肾小球，优选肾间质。
探讨积雪苷(JXG)对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化的保护作用。方法将大鼠随机分为UUO组和UUO+JXG组，另设假手术(SHAM)组。用药组(即UUO+JXG组)于术前三天灌胃给予积雪苷36mg/kg，对照组(即SHAM组)和UUO组给予等体积生理盐水，直至术后第21天处死动物，观察左侧肾脏病理学改变，比较肾间质基质含量和肾间质纤维化程度；以α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫组化观察肾小管上皮细胞转型情况。
本发明的积极进步效果在于本发明通过用积雪苷对大鼠肾间质纤维化的影响，证实了积雪苷具有抗肾脏纤维化的作用。因而，积雪苷可作为活性成份用于制备抗肾脏纤维化的药物。
具体实施例方式
实施例11.材料与方法1.1实验动物wistar大鼠(中国科学院上海实验动物中心)，雄性，健康清洁级，8周龄，体重180～220g，饲养环境为每笼5只，室温22±2℃，相对湿度55±2％。
1.2药物与试剂小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体购自SIGMA公司，兔抗小鼠IgG即用型二抗购自上海抗体公司，DBA显色试剂盒购自华美公司。
1.3方法1.3.1动物模型制作手术时大鼠以10％水合氯醛0.03ml/kg IP麻醉后右卧位固定，剪毛消毒，左侧腹部切口，分离左侧输尿管，5-0号丝线结扎两道，上一道结扎点位于左肾下极水平，在两道结扎点间剪断输尿管，逐层缝合制作UUO模型。假手术组仅开腹并游离左侧输尿管，但不结扎和剪断。
1.3.2动物分组及给药大鼠随机分为三组，分别为假手术(SHAM)组、UUO组和UUO+JXG组，在UUO术前三天开始给药JXG 36mg/kg直至UUO术后第21天。
1.3.3检查项目术后第21天血标本分离出血清检测生化常规，处死动物，抽取UUO大鼠左侧残余尿定量；留取左侧肾脏，肾组织分2部分，一部分作光镜病理检查，另一部分经皮、髓质分离后置于-70℃冻存作α-SMA免疫组化。SHAM大鼠留取左侧肾脏作同样处理。
1.3.4组织病理检查肾组织经4％多聚甲醛缓冲液固定，石蜡包埋后3μm切片，进行PAS和MASSON染色。光镜下观察PAS染色切片皮质肾间质炎细胞浸润程度和纤维化等病理学改变，双盲给予PAS染色下肾间质病变计分，标准为0分(间质病变占间质总量＜5％)；1分(间质病变占间质总量5％-15％)；2分(间质病变占间质总量15％-30％)；3分(间质病变占间质总量30％-60％)；4分(间质病变占间质总量＞60％或有局灶性坏死)。每张切片在放大200倍情况下取10个不重叠的视野，分别对每个视野进行打分，取平均值作为该标本的间质病变计分。对MASSON染色肾组织切片进行半定量分析，具体步骤如下采用北航医学图像分析管理系统，在同一条件下对每张标本选取15个不重复视野(40×)，将呈现为绿色的纤维区域(去除肾小球和大血管)视为阳性目标，以阳性面积与统计场总面积的比值作为肾小管间质的纤维化指数。采用北航医学图像采集和分析系统软件对MASSON染色进行分析。
1.3.5α-SMA免疫组化切片常规脱蜡至无水，浸入37℃含1.5％H2O2的甲醇30min消除内源性过氧化酶，胰蛋白酶消化暴露抗原位点，一抗(小鼠抗大鼠α-SMA抗体，1∶200)4℃过夜，继而以对应即用型二抗(兔抗小鼠IgG，1∶200)37℃放置30min，最后在显微镜下用DAB显色。同时采用删除第一抗体的方法作为阴性对照。在高倍镜下(400×)对每张切片随机选取15个不重叠的视野，采用北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，结果以阳性目标总面积/统计场总面积表示。所有数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析及SNK检验比较各组差异。
2.结果2.1实验大鼠基础指标观察UUO大鼠左侧肾盂及输尿管扩张，内为梗阻后的残余尿。UUO组和UUO+JXG组残余尿量无显著性差异，各组动物血清生化指标均为正常，组间比较无显著性差异，见表1。
表1 UUO模型大鼠基础指标(n＝6)
Triglyceride甘油三酯；Cholesterol胆固醇；Glucose葡萄糖；BUN血清尿素氮；Creatinine肌酐；Resudual Urine残余尿量。
2.2大鼠左肾组织的病理学改变2.2.1PAS染色与SHAM组大鼠相比，UUO后21天肾组织间质增宽，有较多的炎性细胞浸润，肾小管扩张，偶见肾小管管腔内有中性粒细胞聚集，并可见肾小管上皮细胞萎缩、坏死、脱落。UUO+JXG组上述改变明显减轻。各组肾间质病变计分结果见表2。
表2大鼠肾组织病理、免疫组化结果(n＝6)
与SHAM组相比，ap＜0.05；与UUO组相比，bp＜0.05Damage score损伤份数；Interstitial fibrosis index间质纤维化指数；α-SMA Positive areaα-SMA阳性面积。
2.2.2MASSON染色SHAM组切片可见肾小球基底膜有少量绿色着染，小管间几无间隙。UUO后21天肾组织间质增宽且广泛着绿色，显示基质成分增多，纤维化程度明显。UUO+JXG组肾间质纤维化指数明显减轻，见表2。
2.3左肾α-SMA免疫组化检测SHAM组大鼠α-SMA仅表达于肾脏血管平滑肌和血管外膜层细胞，在肾小管和间质几乎无表达。UUO组肾皮质α-SMA染色明显增加，主要位于内髓部，在皮质肾小管上皮细胞及增宽的肾间质区也出现α-SMA阳性表达，提示肾小管上皮细胞向肌纤维细胞转型，间质成纤维细胞明显增多。UUO+JXG组皮质区α-SMA的表达显著减少，见表2。
结论与UUO组比较，UUO+JXG组左侧肾脏的病理改变及肾间质纤维化程度明显减轻(p＜0.05)，肾小管上皮细胞α-SMA的表达明显减少(p＜0.05)，而SHAM组对左侧肾脏病理学无明显影响。积雪苷对UUO所致的大鼠肾间质纤维化具有保护作用，其机制可能部分是通过减少肾小管上皮细胞向肌纤维细胞的转型，从而改善肾间质纤维化。
权利要求
1.积雪苷在制备预防或治疗肾脏纤维化的药物中的应用，其中该积雪苷具有下列化学结构式I 式I。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肾脏为肾间质。
全文摘要
本发明公开了积雪苷在制备预防或治疗肾脏纤维化的药物中的应用。本发明通过用积雪苷对大鼠肾间质纤维化的影响，证实了积雪苷具有抗肾脏纤维化的作用。因而，积雪苷可作为活性成份用于制备抗肾脏纤维化的药物。
文档编号A61P13/12GK101032500SQ200610024400
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者肖璘, 刘全海, 李莉, 贺兴东, 吴学军 申请人:上海医药工业研究院
文档序号 :
【 1018886 】
技术研发人员：肖璘,刘全海,李莉,贺兴东,吴学军
技术所有人：上海医药工业研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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