人miR-23a在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用
[0047] 人成纤维细胞MRC-5和BJ，由中山大学生命科学学院赵勇教授惠赠。
[0048] 2、实验方法
[0049] SI.细胞裂解液准备：按照常规人成纤维细胞培养方法进行培养，收集细胞，用磷 酸缓冲盐溶液（PBS)洗一次；用PBS悬浮，加5X SDS上样缓冲液裂解煮沸。
[0050] 所述培养基的组成为：DMEM培养基、10% FBS。
[0051] S2. SDS聚丙烯酰胺电泳：将样品加入凝胶孔，设程序80V 30分钟，1201小时，样品 跑至凝胶底部。
[0052] S3.湿转膜：将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，设程序200mA 2小时。
[0053] S4.封闭：用质量体积比5%的脱脂奶粉（用TBS配制）做封闭液，封闭一小时。
[0054] S5. -抗结合：孵一抗4°C过夜（12小时），用TBST洗膜3遍，每次5分钟。
[0055] S6.二抗结合（该步骤需避光）：孵二抗，置于室温1小时后TBST洗三次，每次5 分钟。
[0056] S7.检测：使用licor odyssey双色红外激光成像系统进行显色拍照。
[0057] 3、实验结果
[0058] (1)实验结果如附图1所示，内源TRF2在衰老细胞的表达量比年轻的细胞中低，说 明TRF2在衰老过程中受到调控。
[0059] (2)由附图5可知，内源TRF2在miR_23a过表达的细胞中表达比Neg对照组低，说 明miR-23a可抑制内源TRF2的蛋白表达。在挽救（rescue)细胞（miR-23a+TRF2)中，TRF2 的表达量比miR-23a过表达组高，说明TRF2的挽救（rescue)实验成功。其中，shTRF2组 作为正对照，miR-23a+GFP组作为挽救（rescue)实验的负对照。
[0060] 实施例2实时荧光定量PCR实验
[0061] 1、实验方法
[0062] 使用 TRIzol (Invitrogen,货号 15596-026)法提取细胞总 RNA，用 DNase IQnvitrogen,货号 18068015)处理样品，去除残余DNA，再用TAKARA PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录成 cDNA。以 SYBR Green (ABI,货号 4309155)为染料， 进行实时荧光定量PCR实验。设置PCR程序：第一步，95°C 10分钟；第二步：95°C 15秒， 60°C 1分钟，40个循环。溶解曲线程序：第一步，95°C 10分钟；第二步：95°C 10秒，55°C 10 秒，每循环将55 °C提升0. 5 °C，升至95 °C后结束。
[0063] 2、实验结果
[0064] 实验结果如附图2所示，miR_23a在衰老的人成纤维细胞的表达量比在年轻中的 高，这与TRF2的表达（图1)呈负相关。附图4显示miR-23a过表达细胞中，TRF2的mRNA 水平比对照组的低，说明了 miR-23a可降解TRF2的mRNA。
[0065] 实施例3构建miR_23a过表达细胞和挽救（rescue)实验
[0066] 1、实验方法
[0067] 合成含有shTRF2正反序列的oligo引物，通过梯度降温的方式将2条引物退火， 将退火好的含有shTRF2正反序列的双链RNA连接于pLKO载体中。将表达miRNA或shTRF2 的质粒转染HEK293T细胞，制备病毒。用病毒感染人成纤维细胞MRC-5,构建稳定转染细胞 系。挽救（rescue)实验：全长的GFP或TRF2克隆到pBabe-CMV-DEST-SFB中，转染HEK293T 细胞，制备病毒。用病毒感染miR-23a过表达细胞系，构建挽救（rescue)细胞系。对细胞 系进行免疫印迹实验检测蛋白表达。
[0068] 2、实验结果
[0069] 如附图5所示，各组的TRF2和GFP表达情况说明细胞系构建成功。其中，Neg表示 过表达阴性miRNA的对照组细胞系，其为不结合任何哺乳动物mRNA的阴性miRNA，作为实验 的阴性对照组；shTRF2表示过表达shTRF2的细胞系，其为显著抑制TRF2表达的shRNA，作 为实验的阳性对照组；miR-23a表示过表达miR-23a细胞系；miR-23a+GFP表示过表达GFP 的过表达miR-23a细胞系；miR-23a+TRF2表示过表达TRF2的过表达miR-23a细胞系。实 施例4双荧光素酶报告系统实验
[0070] 1、实验方法
[0071] 全长或miR-23a结合位点突变的TRF2 3'UTR克隆到psiCHECK-2双荧光素酶载体 中。将miRNAs表达空载体或miR-23a表达载体和TRF2 3' UTR载体共转染到HEK293T细 胞，48 小时后，裂解细胞，使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit (Promega 公 司，货号E1910)和Perkin Elmer victor X5分光光度计测定和计算荧光素酶活性。
[0072] 2、实验结果
[0073] 实验结果如附图3所示。
[0074] 图 3A 显示了 野生型 TRF2 3' UTR 第 687-693 位（SEQ ID NO. 1)、人 miR-23a(has-miR-23a)(SEQIDN0·2)及突变型TRF2 3'UTR第687-693位（SEQIDN0·3) 的序列。
[0075] SEQ ID NO. 1 :5, CCUGUUAAAACCAGCAAUGUGAG 3，
[0076] SEQ ID NO. 2 :5' AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 3'
[0077] SEQ ID NO. 3 :5, CCUGUUAAAACCAGCUUACACUG 3，
[0078] 图3B显示了 miR-23a在TRF2 3'UTR上的结合位点及荧光素酶活性结果。miR-23a 抑制野生型TRF2 3' UTR约70%的荧光素酶活性，将TRF2 3' UTR上的结合位点突变后， miR-23a无法结合TRF2 3' UTR，荧光素酶活性回复到对照组的水平，说明了 miR-23a抑制 TRF2的表达是通过直接作用于3' UTR上第687-693位。
[0079] 实施例5细胞生长曲线实验
[0080] 1、实验方法
[0081] 将1000个细胞接种到6孔板中，种9个孔，在接下来的48小时（day 2)，96小时 (day 4)和144小时（day 6)分别消化3个孔的细胞，用血球计数板计数，取平均值，计算标 准偏差和t检验。
[0082] 2、实验结果
[0083] 如附图6所示，miR_23a过表达细胞生长速度比Neg对照组慢，且这种效应可被过 表达TRF2逆转（miR-23a+TRF2组），而过表达GFP (miR-23a+GFP组）则无法逆转。shTRF2 组作为正对照。这说明了 miR-23a抑制TRF2表达，延缓细胞生长。
[0084] 实施例6衰老相关β半乳糖苷酶染色实验
[0085] 1、实验方法
[0086] 将细胞接种到6孔板中，24小时后，使用衰老相关β半乳糖苷酶染色试剂盒（Cell signaling technology,货号 9860)进行染色。使用 IX fixation solution 室温固定细胞 10分钟，IX PBS洗3次，每次5分钟，然后用lx staining solution在37°C染色过夜（12 小时）。在显微镜下观察，拍照，阳性细胞计数。
[0087] 2、实验结果
[0088] 附图7显示，衰老的细胞β半乳糖苷酶活性高，细胞被染成蓝色。miR_23a过表达 组的衰老阳性细胞数比Neg(Negative)对照组显著增多，且这种效应可被过表达TRF2逆转 (miR-23a+TRF2组），而过表达GFP (miR-23a+GFP组）则无法逆转。这说明了 miR-23a抑制 TRF2表达，加速细胞衰老。
【主权项】
1. miR-23a或miR-23a调控剂在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。 2. miR-23a或miR-23a表达正向调控剂在制备细胞生长延缓剂或加速细胞衰老制剂中 的应用。 3. miR-23a抑制剂在制备抗衰老制剂中的应用。4. 如权利要求1-3任一权利要求所述的应用，其特征在于所述的miR-23a为人 miR-23a〇 5. miR-23a抑制剂在制备皮肤抗衰老制剂中的应用。 6. miR-23a在制备TRF2表达抑制剂中的应用。 7.miR-23a在制备TRF2 3'UTR结合剂上的应用。8. -种细胞生长和/或衰老调控剂，其特征在于，含有miR-23a。9. 如权利要求8所述的调控剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。10. -种检测或预测细胞生长/衰老速度的试剂，其特征在于含有miR-23a检测试剂。
【专利摘要】本发明提供了人微RNA(microRNAs)miR-23a在制备细胞生长和衰老调控剂中的应用。所述人微RNA(microRNAs)miR-23a在衰老的人成纤维细胞中高表达。miR-23a直接作用于人端粒蛋白TRF2的信使RNA(mRNA)的3’-非翻译区(3’UTR)，抑制TRF2的mRNA和蛋白表达。在人成纤维细胞MRC-5中，过表达miR-23a可降低细胞生长速度和加速细胞衰老。因此，miR-23a在细胞生长和衰老过程中有着重要的调控功能，可以针对miR-23a开发有效的细胞生长和衰老的调控剂，延缓细胞衰老过程。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K48/00, A61P39/06
【公开号】CN105435242
【申请号】CN201410443387
【发明人】黄军就, 松阳洲
【申请人】佛山市龙杰生物科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月2日
文档序号 :
【 9676271 】
技术研发人员：黄军就,松阳洲
技术所有人：佛山市龙杰生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：黄军就,松阳洲
技术所有人：佛山市龙杰生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除