治疗嗜酸细胞性食管炎的方法与流程

本申请为国际申请pct/ep2010/063019于2012年4月25日进入中国国家阶段、申请号为201080048257.4、发明名称为“治疗嗜酸细胞性食管炎的方法”的分案申请。

本发明涉及嗜酸细胞性食管炎(ee)的治疗。更具体地，本发明涉及经表皮途径治疗ee的新方法。具体地，本发明的方法包括将包含组合物的皮肤贴片装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于对象的皮肤。本发明也涉及皮肤贴片装置和所述皮肤贴片装置在制造用于治疗对象的嗜酸细胞性食管炎的组合物中的应用。

背景技术：

嗜酸细胞性食管炎(ee)的特征在于食管的嗜酸性粒细胞浸润(1)。根据美国、瑞士和澳大利亚的研究(2)，ee已变得越来越普遍。例如，在费城儿童医院(thechildren'shospitalofphiladelphia)，从1994年的2例到2003年的72例，增加了35倍(3)。

ee的症状已被描述为提示胃食管反流的症状，所述症状对胃食管反流病(gerd)药物无响应。ee的其他症状包括吞咽困难，特别是在年轻成人中，以及婴儿的成长障碍(4)。自然史是未知的，但几项研究提示了未经治疗的疾病的可能进程。noel等(5)在年龄对主诉的回顾性研究中在最年幼的儿童(中位年龄2.0岁)中发现进食困难，在年龄较大的儿童(中位年龄8.1岁)中发现呕吐，在青少年(中位年龄12.0岁)中发现腹痛，以及在成人中发现吞咽困难(平均年龄13.4岁)和食物嵌塞(中位年龄16.8岁)。这个回顾性数据的一种可能分析是，作为未经治疗的疾病的自然史，从婴儿的进食困难到成人的狭窄和食物嵌塞，症状逐步进展并可能恶化。在成年人群中，straumann等(6)在30名成人的11年随访中发现疾病没有缓解。

ee的起因与变态反应有关。经皮肤点刺试验反应、rast结果或两者确定，大多数患者具有食物和空气变应原过敏的迹象。然而，只有少部分患者具有食物过敏反应史，这表示与经典的ige介导的肥大细胞/嗜碱细胞活化相比有截然不同的机制。ee涉及的免疫机制尚不清楚。已经证实，il5和嗜酸性粒细胞趋化因子增强嗜酸性粒细胞向肠粘膜的迁移。因此，ee中免疫反应的特征在于对食品和环境变应原两者作出反应，增加th2相关的细胞因子产生。ee和特应性皮炎(ad)具有共同的特征，包括嗜酸性粒细胞浸润、嗜酸性粒细胞脱颗粒和鳞状上皮细胞增生，提示可能运行了共同的发病机制。

确定ee是通过食管粘膜中出现高水平的嗜酸性粒细胞(>20-24个嗜酸性粒细胞/高倍视野)，并伴随着广泛的上皮增生。嗜酸性粒细胞位于食管近端和远端两者中。此外，ee患者的食管组织表现出粘膜增厚以及基底层增生和乳突延长。ee伴随着食管运动功能障碍，运动障碍的原因不清楚，但嗜酸性粒细胞活化和脱颗粒已被假定为一个可能的原因。放射线成像和内窥镜检查研究已显示许多发现结果，包括狭窄、粘膜环、溃疡、白色丘疹和息肉。

ee的评估包括利用皮肤点刺试验或利用rast寻找食物和空气变应原致敏的扩大的变态反应评价、排除gerd、以及嗜酸性粒细胞在食管中的其他原因。最近的研究已表明，与单独的皮肤点刺试验相比，利用迟发型皮肤贴片试验评价食物蛋白致敏提高了食物变态反应的鉴定。值得注意的是，存在gerd并不排除ee或食物变态反应的诊断，这说明了食物变态反应评价在这些患者中的重要性。

通过利用皮肤点刺试验和特应性贴片试验在ee人群中鉴定到的最常见的食物是乳、蛋、小麦、大豆和花生。

ee发作中所涉及的最常见的空气变应原是花粉和屋尘螨(hdm)。

对于特应性ee患者，往往适合进行特定食物抗原禁忌试验，如果令人不满意或有实际困难(当患者对许多变应原致敏时)，则提倡由要素配方组成的饮食。有趣的是，已经表明，要素饮食常常改善原发性ee(变应性或非变应性亚型)患者的症状并降低其食管活检标本中嗜酸性粒细胞的数量。要素饮食的患者常常需要放置胃管，以达到足够的热量支持。糖皮质激素(全身或局部)也已经被使用，结果令人满意。全身性类固醇是用于急性恶化，而局部类固醇是用于提供长期控制。在无对照的开放标签研究中，已表明局部氟替卡松降低近端和远端食管中嗜酸性粒细胞和cd8+细胞的水平。然而，据报道，用局部氟替卡松治疗的一些患者有食管念珠菌病。

看起来，ee需要类似于变应性哮喘那样的长期治疗。尽管ee的自然史还没有被广泛了解，但ee儿童的父母有长期食管狭窄史却并不少见。事实上，在一些病例中，来自这样的父母的食管活检切片检查显示ee长期存在。因此，可能的是，慢性ee如果任其不治疗，可以发展成进行性食管瘢痕及功能障碍。患巴雷特食管炎(barrett'sesophagitis)的风险、尤其是在ee和gerd同时存在的患者中的风险尚未被确定，但这肯定是值得关注的。此外，ee患者发生其他形式的消化性疾病的风险增加，因此要保证通过内窥镜检查对整个胃肠道进行常规监测。

因此，ee是一种严重的食管疾病，其以越来越高的频率发生在儿童、青少年和年轻成人中。目前，它通过食物禁忌和皮质激素进行治疗。

尽管用皮下免疫疗法(scit)报道了有希望的结果，但由于高水平的严重副作用或不良事件(ae)，这种方法不再被用于食物变态反应。目前，作者赞成口服途径，即特异性口服耐受诱导(soti)或口服免疫疗法(oit)，其利用逐渐增加的口服剂量和可变的时间表(从1周到至少1年以上)，或舌下技术(slit)。这些方法是有前途的，并且它们的功效已经被证实。然而，在ee中，口服途径还没有经过试验。此外，由于食管粘膜与变应原接触，它可能引起ee恶化。

因此，需要安全、有效和患者耐受良好的治疗ee的新方法。

技术实现要素：

本发明提供了治疗ee的新方法。更具体地，本发明首次表明，ee的有效免疫疗法可以通过表皮途径实现。本发明表明，施用本发明的皮肤贴片装置可引起食管中嗜酸性粒细胞浸润显著减少以及ee的其他组织学形态的减少。

具体地，本发明涉及治疗对象的嗜酸细胞性食管炎的方法，该方法包括将包含含有引起皮肤免疫反应的物质的组合物的皮肤贴片装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于对象的皮肤。

更具体地，本发明涉及包含含有引起皮肤免疫反应的物质的组合物的皮肤贴片装置在制造用于通过将所述装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于皮肤来治疗对象的嗜酸细胞性食管炎的组合物中的应用。在本发明优选的实施方式中，所述物质是变应原，优选选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨或其组合物的食物或呼吸性变应原。

本发明的另一个实施方式涉及用于治疗对象的嗜酸细胞性食管炎的包含组合物的闭合性皮肤贴片装置，所述组合物包含经静电力附着于所述贴片的、干燥形式的、引起皮肤免疫反应的物质。

本发明的另一个具体实施方式涉及上面所定义的闭合性皮肤贴片装置在制造用于治疗嗜酸细胞性食管炎的组合物中的应用。

本发明的另一个优选实施方式涉及预防或降低变应性对象的嗜酸细胞性食管炎风险的方法，所述方法包括将包含含有引起皮肤免疫反应的物质的组合物的皮肤贴片装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于对象的皮肤。

本发明也涉及降低变应性对象的食管或肠中嗜酸性粒细胞浸润的方法，所述方法包括将包含含有引起皮肤免疫反应的物质的组合物的皮肤贴片装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于对象的皮肤。

本发明也涉及包含组合物的闭合性皮肤贴片装置，所述组合物包含选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨变应原的至少两种变应原的组合，优选干燥形式，并优选经静电力附着于贴片。

附图说明

图1是显示表皮治疗期间小鼠血清中特异性ige水平演变的图。nt：致敏的未处理小鼠，epit：致敏的处理小鼠，c：对照小鼠。用平均值表现，并表示为μg.ml^-1±sd。

图2是显示表皮治疗期间小鼠血清中特异性igg2a水平演变的图。nt：致敏的未处理小鼠，epit：致敏的处理小鼠，c：对照小鼠。用平均值表现，并表示为μg.ml^-1±sd。

图3是显示致敏小鼠食管的一个视野的图。箭头表示着色的嗜酸性粒细胞。

图4是表现每组(nt、epit和c)的嗜酸性粒细胞定量的图。结果表示为每平方毫米嗜酸性粒细胞的平均值±sd。

发明详述

本发明涉及通过表皮免疫疗法治疗对象的ee的方法。

具体地，本发明的方法涉及治疗对象的ee的方法，所述方法包括将包含组合物的皮肤贴片装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于对象的皮肤，所述组合物包含引起皮肤免疫反应的物质。

本发明有利地表明，这样的方法引起嗜酸性粒细胞浸润的显著减少，这不仅限于食管，而且还有肠的其他部分例如空肠、胃和结肠。

更具体地，本发明涉及包含组合物的皮肤贴片装置在制造用于治疗对象的嗜酸细胞性食管炎的组合物中的应用，所述组合物包含引起皮肤免疫反应的物质。

在具体的实施方式中，所述对象遭受对食物变应原或空气变应原的过敏性/变态反应。在特定的实施方式中，对象对数种食物变应原或/空气变应原具有变应性。

在本发明优选的实施方式中，对象患有食物和/或呼吸性变应原的组合所引起的ee。

在具体的实施方式中，本发明的物质是ee所涉及的最常见变应原的组合。

在另一个实施方式中，本发明涉及方法，其中数种(例如至少2、3、4种或更多)变应原通过一个或多个贴片装置分别、相继或同时施用于皮肤上。

本发明的另一个目标涉及贴片，其包含选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨的一种或多种变应原，优选数种变应原的组合。

在具体的实施方式中，本发明涉及包含组合物的皮肤贴片装置，所述组合物包含引起皮肤免疫反应的物质，通过将所述装置在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于皮肤上以用于治疗对象的嗜酸细胞性食管炎。

在另一个具体实施方式中，变应原通过静电力保持在贴片上，其中所述贴片在允许所述组合物与皮肤之间接触的条件下施用于对象的皮肤。

本发明又一个实施方式在于上面所描述的闭合性贴片装置在制造用于治疗ee的组合物中的应用。

本发明的另一个具体目标涉及用于治疗对象的ee的包含组合物的闭合性皮肤贴片装置，所述组合物包含选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨变应原的一种变应原、或优选至少两种变应原的组合，优选为干燥形式，并优选经静电力附着于贴片。

本发明的另一个具体目标涉及包含组合物的闭合性皮肤贴片装置，所述组合物包含选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨变应原的至少3种变应原的组合，优选为干燥形式，并优选经静电力附着于贴片。

本发明的另一个具体目标涉及包含组合物的闭合性皮肤贴片装置，所述组合物包含选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨变应原的至少4种变应原的组合，优选为干燥形式，并优选经静电力附着于贴片。

本发明的另一个具体目标涉及包含组合物的闭合性皮肤贴片装置，所述组合物包含选自乳、蛋、小麦、大豆、花生、花粉和屋尘螨变应原的5种或更多变应原的组合，优选为干燥形式，并优选经静电力附着于贴片。

在具体的实施方式中，本发明涉及用于治疗ee的闭合性皮肤贴片装置，其包含干燥形式的变应原。

本发明提供用于治疗ee的新的表皮免疫疗法，其包括利用包含背衬的皮肤贴片装置通过表皮途径将组合物(重复)给药于所述对象，所述背衬的周缘适合与皮肤产生一个不透气的封闭腔，其中所述背衬在所述腔内其面对皮肤侧上携带了所述一种或多种蛋白，蛋白的剂量足以在贴片装置施用于皮肤后降低所述对象的皮肤反应性，所述组合物在贴片装置施用于皮肤后从背衬中移下，并在此后经表皮途径递送至对象，所述给药经重复后导致皮肤反应性逐步降低。

在另一方面，本发明也涉及包含背衬的皮肤贴片装置在制造用于治疗对象的ee的变应原组合物中的应用，所述背衬的周缘适合与皮肤产生一个不透气的封闭腔，其中背衬在所述腔内其面对皮肤侧上携带了变应原。

在一个具体方面，在本发明中，背衬携带了下列变应原的蛋白提取物的组合：乳、蛋、花生、小麦、大豆。

在一个具体方面，在本发明中，背衬携带了乳和小麦的蛋白提取物的组合。

本发明可以用于任何对象，例如动物或人类对象，并且特别是任何人类对象，包括儿童和成人。

本发明的免疫治疗方法包括利用具体的贴片装置通过表皮途径将变应原组合物给药于对象，导致肠中嗜酸性粒细胞浸润减少。

在本说明书中使用时，术语“表皮途径”表示通过将变应原施用于皮肤上而将该变应原给药于对象。表皮途径不需要使用针、注射器或任何其他方式来穿孔或改变表皮浅表层的完整性。在足以允许变应原渗透入表皮角质层的时间段和条件下，保持变应原与皮肤接触。经重复和/或延长皮肤施用后，变应原可以激活皮肤的郎格汉斯细胞(langheranscell)和树突细胞，使它们迁移到淋巴结并激活免疫细胞。

术语“治疗”包括患者肠粘膜的嗜酸性粒细胞浸润减少，从而导致ee消失。在具体的实施方式中，治疗是预防性的，并旨在降低或预防对象、特别是变应性对象的ee发作或发展。这种预防性治疗一般包括在ee出现症状之前或在其早期阶段重复施用所述装置。

在另一个实施方式中，治疗是治疗性的，并旨在降低或抑制疾病的进展或促使其消退。

在优选的实施方式中，变应原选自食物变应原和呼吸性变应原。

在优选的实施方式中，变应原组合物包含一种或多种蛋白质。

在特定的实施方式中，变应原组合物是液体形式，例如微粒的溶液或分散体。在那种情况下，通过变应原从变应原组合物的液相迁移到皮肤，从而允许变应原透入表皮角质层，来确保有效的表皮给药。在具体的实施方式中，通过变应原扩散通过不透气的封闭腔内例如由于出汗而形成的凝结水来确保变应原迁移出变应原组合物的液相。

在另一个实施方式中，变应原组合物是干燥的形式，特别是例如通过冷冻干燥法获得的颗粒形式。使用具体干燥形式的蛋白质是有利的。事实上，这样的颗粒变应原可以直接附着于装置的背衬，从而避免任何化学相互作用或任何可能干扰这些蛋白质的免疫原性的反应。此外，使用微粒允许在适当的包装中保存物质，因而不再有进行临时制备的任何需要。在这种情况下通过这些变应原溶解在不透气的封闭腔内所形成的凝结水中，可以确保贴片背衬上所保有的变应原的表皮给药。

变应原组合物还可以包含其他成分，例如佐剂。

在实施方式中，配制本发明所用的组合物不用任何佐剂。

在另一个实施方式中，本发明所使用的变应原组合物包含佐剂或与佐剂一起施用。在本发明的情形中，佐剂是指在与特定抗原组合使用时发挥作用以激活、加快、延长或增强抗原特异性免疫响应的任何物质。可以与组合物变应原组合使用的佐剂化合物包括矿物盐，例如磷酸钙、磷酸铝和氢氧化铝；免疫刺激性dna或rna，例如cpg寡核苷酸；蛋白质，例如抗体或toll样受体结合蛋白；皂甙，例如qs21；细胞因子；胞壁酰二肽衍生物；lps；mpl及衍生物，包括3d-mpl；gm-csf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；咪喹莫特；胶体微粒；完全或不完全弗氏佐剂；ribi佐剂或细菌毒素，例如霍乱毒素或肠毒素(lt)。本发明方法中所使用的皮肤贴片装置优选包含背衬，所述背衬的周缘适合与皮肤产生不透气的封闭腔。该背衬在所述腔内其面对皮肤侧上携带了用于降低皮肤反应性的组合物。

优选地，背衬的周缘具有粘性并形成气密性连接，从而与皮肤产生不透气的封闭腔。

在具体的实施方式中，组合物变应原通过静电力和/或范德华力保持在背衬上。在组合物变应原是固体或干燥形式(例如微粒)的情况下，这个实施方式特别适合，尽管它也可以间接地用于变应原是液体形式的情况。

在本发明的情形中，术语“静电力”通常是指涉及电荷的任何非共价力。术语“范德华力”是指背衬表面和固体变应原之间产生的非共价力，并可以是3种类型：永久偶极力、诱导偶极力和伦敦范德华力。静电力和范德华力可以分别或一起发挥作用。

在这方面，在优选的实施方式中，贴片装置包含静电性背衬。在本文中使用时，“静电性背衬”这个表述是指由能够通过例如摩擦、加热或电离积累静电电荷和/或产生范德华力并保存这种电荷的材料所制成的任何背衬。静电性背衬典型地包括带有空间电荷的表面，空间电荷可以均匀或不均匀地分散。根据构成所述背衬的材料和用于产生电荷的方法，出现在背衬表面的一侧或另一侧的电荷可以是正的或负的。在所有情况下，分布在背衬表面上的正或负电荷对传导性或非传导性材料产生吸引力，从而允许保持变应原。微粒也可以是电离的，从而在微粒和背衬之间产生相同类型的静电吸引力。

适合于提供静电性背衬的材料的实例是玻璃或选自纤维素塑料(ca、cp)、聚乙烯(pe)、聚乙烯对苯二甲酸酯(pet)、聚氯乙烯(pvc)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸特别是聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)和含氟聚合物(例如ptfe)的聚合物。上述名单绝不是限制性的。

背衬的背面可以用标签覆盖，标签可以在施用前揭去。这个标签可以使，例如，在背衬至少部分半透明时将组合物变应原保存在黑暗中。

通过因存在水分而存在的薄薄的水膜，可以提高或降低表面和粒子之间的力的强度。通常，贴片是在干燥的地方制造并保存。水分应低到足以允许保存活性成分。水分比率可以进行调节，以达到最大的粘附力。如上所述，在变应原是干燥形式例如微粒形式的情况下，使用静电性背衬是特别有利的。此外，微粒大小可以由专业人员进行调整，以改善静电力和/或范德华力的效率，从而将微粒保持在支持物上。

在特定的实施方式中，贴片包括聚合物或金属涂层的聚合物背衬，并且组合物变应原微粒基本上依靠范德华力保持在背衬上。优选地，为了通过范德华力将微粒保持在支持物上，微粒的平均尺寸为小于60微米。在另一个实施方式中，变应原利用背衬上的粘性涂层保持在背衬上。背衬可以用粘性材料完全覆盖或仅部分覆盖。可以使用不同的闭合性背衬，例如铝涂层的聚乙烯或pet膜，或具有粘性层(丙烯酸、有机硅等)的pe、pvc或pet泡沫。

颗粒形式的物质可以利用喷雾干燥过程、例如国际专利申请no.wo2009/095591中所描述的电喷雾过程负载在背衬上。电喷雾装置利用高电压将液体分散成细小的气溶胶。接着，溶解在溶剂中的变应原雾化在贴片背衬上，溶剂在背衬上蒸发，留下微粒形式的变应原。根据所需要的蒸发时间，溶剂可以是例如水或乙醇。专业人员可以选择其他溶剂。将物质施加在贴片背衬上的这种类型的过程允许纳米大小和单一大小的微粒并且粒子在背衬上规律均匀地重新分配。这种技术适合于任何类型的贴片例如具有背衬的贴片，所述背衬包含绝缘聚合物、掺杂的聚合物或覆盖了传导层的聚合物。优选地，背衬包含传导性材料。

在另一个实施方式中，背衬的周缘覆盖了干燥的亲水性聚合物，亲水性聚合物通过与润湿的皮肤接触能够形成粘性水凝胶膜(如国际专利申请no.wo2009/050403中所描述的)。在这个实施方式中，皮肤必须在施用贴片前被润湿。当水凝胶接触到润湿的皮肤，聚合物微粒吸收液体并变成具有粘性，从而在贴片施用于皮肤时形成不透气的封闭腔。这种水凝胶的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、甲基乙烯基醚和马来酸酐的共聚物。

在另一个具体实施方式中，液体组合物变应原保持在贴片的支持物上的吸附性材料储存库中。组合物可存在于变应原溶液中或变应原的分散液中，例如甘油中。吸附性材料可以由例如醋酸纤维素制成。

根据组成材料，背衬可能是刚性的或柔性的，可可以是或可以不是亲水性的，并可以是或可以不是半透明的。在玻璃的情况下，通过将一片塑料与上述玻璃粘合，支持物可以被制成抗破裂的。

在一个实施方式中，贴片的背衬包含透明区域，允许直接观察和控制炎症反应，而不必要移开贴片。适合的透明材料包括聚乙烯膜、聚酯(聚对苯二甲酸乙二酯)膜、聚碳酸酯和各种透明或半透明的生物相容性膜或材料。

在具体的实施方式中，背衬中携带变应原的部分不与皮肤直接接触。在这个实施方式中，由背衬、背衬的周缘和皮肤所限定的腔的高度是0.1mm至1mm。

本发明的方法典型地包括，如上所公开，将本发明的装置重复施用于对象，导致对象的皮肤反应性逐步降低。

变应原确切的剂量以及施用的次数和接触的持续时间可以由专业技术人员根据对象、变应原制剂的性质、所使用的贴片装置的类型等进行调整。

每个贴片上组合物变应原的量典型地是0.1μg/cm²至1000μg/cm²贴片表面，优选20μg/cm²至500μg/cm²贴片表面，更优选20至200μg/cm²贴片表面。贴片表面在1cm²至10cm²的范围，优选在1cm²至5cm²的范围。

对于施用，贴片装置可以不用任何预处理直接施用于皮肤，优选身体无毛发的部位。或者，皮肤可以在装置施用前进行处理，以在与贴片装置接触的部位破坏角质层、去除毛发或仅仅引起皮肤的水化。

如实验部分中所公开的，本发明的方法引起对象肠粘膜中嗜酸性粒细胞逐步减少。

本发明也涉及上面所描述的皮肤贴片装置在制造用于预防或治疗对象的ee的组合物中的应用。

具体实施方式

给出下面的实施例是用于说明目的，而不是作为限制。

实施例

方法

研究设计

epit治疗嗜酸细胞性食管炎(ee)的可行性和功效在对花生致敏的小鼠模型中进行评价。在致敏阶段后，动物被分成2组：未治疗组(nt组)和治疗组，治疗组利用进一步描述的(epit)的表皮递送系统，每周一次通过表皮进行治疗，总时程为8周。对照组(c)也由未致敏的动物组成。在实验开始和结束时，血液被采样用于分析，并且在花生变应原口服激惹后作组织学分析。

动物和蛋白提取物

购自查尔斯河实验室(charlesriverlaboratories)(法国)的四周龄雌性balb/c小鼠(n＝30)被花生蛋白致敏。利用balb/c小鼠作为对花生蛋白致敏的鼠模型描述在adel-patient等，2005中。这种模型在激惹后应重现在变应性人类中所观察到的良好的ige特异性和症状。所有实验均根据欧洲共同体动物管理条例执行，并具有法国兽医服务许可92-305。

所使用的花生蛋白提取物(ppe)购自greer实验室(美国)。

致敏方案

在第1、6、12、18、24、30天，通过胃内管饲法，20只balb/c小鼠接受1mg混有10μg霍乱毒素(ct)的均质ppe。在第43天，从眼窝后静脉丛收集血清，离心，并将样品保存在-20℃直至进一步分析。未接触免疫原的小鼠在同一天取血(n＝10)。通过上面所定义的生物学参数监测致敏。

处理方案

epit在8周时间内如下所述每周执行一次：

小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪进行腹膜内麻醉，并用电动剪毛器和脱毛膏去毛。第2天，带有背衬的皮肤贴片装置被置于小鼠的背上，并用绷带保持48小时，所述背衬包含由含100μgppe的溶液所形成的水凝胶，所述背衬的周缘适合与小鼠皮肤产生不透气的封闭腔。

epit期间每2周抽取血液样本，以及在处理结束时(d98)抽取血液样本，以测定血清学反应。

变应原食物激惹和食管取样

处理结束时，小鼠在连续3天内只喂花生仁。接着，重新引入标准食物，并且小鼠在连续3天内通过胃内给药接受了50mg花生粉。然后，杀死小鼠，取出食管并固定在10％中性福尔马林缓冲液中，用石蜡包埋并切成5μm的切片。制备切片，并用hemaluneosinsafran染色。

组织学分析(食管中的嗜酸性粒细胞)

着色的切片由ecvp(europeancollegeofveterinarypathologists，欧洲兽医病理学家学院)认证的解剖病理学家进行盲法分析。每张切片首先做描述性判断，然后对6个代表性视野的嗜酸性粒细胞进行定量。结果表示为嗜酸性粒细胞/mm²组织面积。

特异性ige、igg1、igg2a的定量

在免疫治疗前和期间，从眼窝后静脉丛收集血液样本，血浆保存在-30℃直至进一步分析。

利用fda2001指南验证过的定量elisa被用于特异性ige、igg1和igg2a。简言之，微量滴定板用作用浓度为10μg/ml的ppe进行包被。100μl的各血清连续稀释液被分配到每个孔中，并在4℃孵育24小时。碱性磷酸酶标记的抗-小鼠igg1或igg2a抗体(serotec，英格兰)被用作示踪剂。试剂(pnpp)(sigma，法国)被用作酶底物。与在相同的条件下使用与示踪剂互补的抗-小鼠ige、igg或igg2a抗体(serotec，英格兰)代替花生蛋白包被的固相来执行总ige、igg1或igg2a分析所获得的浓度-响应曲线进行比较，来定量特异性ige、igg1和igg2a。小鼠免疫球蛋白标准品从serotec获得。

统计学分析

graphpad软件(圣地亚哥，美国)被用于统计学分析。处理小鼠与对照小鼠比较时，血清学数据利用方差分析(anova)和dunnett检验进行分析，或者，在所有组互相比较时，利用方差分析和tukey检验。对于嗜酸性粒细胞计数，数据表示为平均值±sd。比较不同组小鼠的统计学显著性是利用t检验进行确定。

结果

血清学反应

ige和igg1：花生致敏的具体特征在于在第43天产生特异性ige，如图1所示。epit后，与nt组(0.166±0.01μg/ml)相比，ep组(0.139±0.01μg/ml)的特异性ige显著降低(p<0.05)。此外，在免疫治疗期间，没有观察到特异性igg1的改变(数据未显示)。

igg2a：epit8周后处理小鼠(图2)与nt小鼠(图2)相比，特异性igg2a显著增加，分别为14.96±0.60对4.73±1.75μg/ml(p<0.05)。

为了证实从th2主导型到th2/th1均衡型的免疫偏离，对每组的igg1/igg2a比进行评估。仅ep组的igg1/igg2a比降低(从0.036至0.006)而nt组不降低(从0.038至0.041)，这表明th1型增加以获得更均衡的th2/th1型。

组织学分析：嗜酸性粒细胞定量

嗜酸细胞性食管炎在致敏的nt小鼠中产生，如图3所示，在图中可以观察到大量的嗜酸性粒细胞。致敏nt小鼠的嗜酸性粒细胞浸润(136±32个嗜酸性粒细胞/mm²)显著高于对照小鼠(7±3个嗜酸性粒细胞/mm²)(p<0.01)(图4)。

表皮处理将嗜酸性粒细胞的数量显著降低至平均值50±12个嗜酸性粒细胞/mm²(p<0.05)(图4)。

结论

引起从th2主导型到th2/th1再平衡型的免疫偏离的表皮处理看起来在对花生致敏的小鼠临床前模型中可有效预防嗜酸细胞性食管炎。

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