用于预防和治疗高表达wt1肿瘤的黑猩猩腺病毒疫苗的制作方法
[0042]1.3重组腺病毒载体pAdC68_WTl构建
[0043]将tffTl in pUC57_Amp 质粒用 Xba I 和 Kpn I 酶切后，克隆入 pShuttle 的 Xba I和 Kpn I 位点，形成 pShuttle-WTl。用 1-CeuI 和 P1-SceI 酶切 pShuttle_WTl，将切出的片断克隆入pAdC68载体的1-CeuI和P1-SceI位点，形成携带靶基因的质粒pAdC68_WTl，如图
3。酶切鉴定结果见图5。
[0044]1.4 重组腺病毒载体 pAdC68- (GM-CSF) -P2A- (IL-4) -F2A- (WTl)构建
[0045]将(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl)in pUC57_Amp质粒用 Xba I 和Kpn I 酶切后，克隆入 pShuttle 的 Xba I 和 Kpn I 位点，形成 pShuttle-GIW。用 Ι-Ceul 和 ΡΙ-SceI 酶切pShuttle-GIW，将切出的片断克隆入pAdC68载体的1-CeuI和P1-SceI位点，形成携带靶基因的质粒 pAdC68- (GM-CSF) -P2A- (IL-4) -F2A- (WTl)，简称为 pAdC68_GIW，如图 4。酶切鉴定结果见图5。
[0046]1.5重组腺病毒的制备和鉴定
[0047]重组黑猩猩腺病毒疫苗的制备流程图见图6。大量纯化质粒后用Sgfl酶切线性化载体后用Lipofectamine 2000转染HEK293细胞，收集病毒，在HEK293细胞中扩增病毒。提取病毒基因组DNA，用Bgl I1、Xho I和Mfe I酶切后，行凝胶电泳鉴定切下的片断大小是否正确，结果见图7。为检测病毒的稳定性，对第5和第15代腺病毒再次进行酶切鉴定，结果见图8。同时为检测病毒毒力进行病毒滴度实验，AdC68-WTl和AdC68-GIW分别以18和10lcVp/mL感染HEK 293细胞，24h后观察，结果见图9。
[0048]2.小鼠乳腺癌模型建立
[0049]4T1细胞是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌噙抗性细胞株。在BALB/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近。实验小鼠购于中国医学科学院血液学研宄所实验动物中心。4T1细胞购买于国家实验细胞资源共享平台。细胞培养于含10%FBS、50yg/mL链霉素及50U/mL青霉素的PMRI 1640培养液，置于37°C、50mL/L CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞接种于胸壁乳腺皮下部位，每只接种I X 15个，通过该方法建立小鼠乳腺癌模型。
[0050]3.检测腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性作用[0051 ] 3.1将小鼠随机分为5组，每组5只:
[0052].NC组，非造模组；
[0053].PBS组，造模并给予PBS ；
[0054].Ad对照组，造模并给予空病毒，5 X 110Vp/只；
[0055].WTl-Ad组，造模并给予表达WTl的病毒，5 X 1icVp/只；
[0056].GIff-Ad 组，造模并给予表达 WT1-P2A- (GM-CSF) -P2A- (IL-4) -WTl 的病毒，5 X 1icVp/ 只。
[0057]在造模前21、14、7及造模当天在小鼠后大腿肌肉注射相应试剂，并检测体重、月中瘤大小及生存情况(图10)。
[0058]3.2腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄的各组体重监测
[0059]如图11所示，各组体重没有明显差别。
[0060]3.3腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄的各组肿瘤体积监测
[0061]如图12所示，与只注射黑猩猩腺病毒(Ad control)相比，WTl疫苗注射组和GIW疫苗注射组小鼠的肿瘤体积没有减低。
[0062]3.4腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄的生存期监测
[0063]WTl疫苗注射组和GIW疫苗注射组小鼠的生存期均延长，GIW疫苗注射组生存期延长更为明显(图13)。
[0064]4.检测腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性作用
[0065]4.1将小鼠随机分为5组，每组5只:
[0066].NC组，非造模组；
[0067].PBS组，造模并给予PBS ；
[0068].Ad对照组，造模并给予空病毒，5 X 110Vp/只；
[0069]^WTl-Ad组，造模并给予表达WTl的病毒，5 X 1icVp/只；
[0070].GIff-Ad 组，造模并给予表达 WT1-P2A- (GM-CSF) -P2A- (IL-4) -WTl 的病毒，5 X 1icVp/ 只。
[0071]在造模当天、造模后第1、8及15天在小鼠后大腿肌肉注射相应试剂，并检测体重、肿瘤大小及生存情况(图14)。
[0072]4.2腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄的各组体重监测
[0073]如图15所示，与Ad control组相比，WTl-Ad和GIW-Ad组体重明显升高。
[0074]4.3腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄的各组肿瘤体积监测
[0075]如图16所示，各组体重没有明显差异。
[0076]4.4腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄的生存期监测
[0077]WTl疫苗注射组和GIW疫苗注射组小鼠的生存期均延长，GIW疫苗注射组生存期延长更为明显(图17)。
[0078]以上结果提示，预防性和治疗性给予腺病毒疫苗能够显著延长乳腺癌模型小鼠的生存期，研宄结果为表达WTl的黑猩猩腺病毒疫苗的临床应用提供了实验基础。
【主权项】
1.用于预防和治疗高表达WTl肿瘤的黑猩猩腺病毒疫苗，其特征在于，含有WTl基因或同时含有GM-CSF、IL-4和WTl基因，并能够表达WTl基因或同时表达GM-CSF、IL-4和WTl基因。
2.如权利要求1所述的腺病毒疫苗，其特征在于，所述的腺病毒为黑猩猩腺病毒。
3.如权利要求1所述的腺病毒疫苗，其特征在于，含有(GM-CSF) -P2A- (IL_4) -F2A- (WTI)基因。
4.如权利要求3所述的腺病毒疫苗，其特征在于，所述的(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl)核苷酸序列如 SEQ N0.4 所示。
5.一种制备如权利要求1-4中所述腺病毒疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤:(I)质粒合成；(2)重组腺病毒载体构建；(3)重组腺病毒的制备和鉴定。
6.如权利要求5所述的制备腺病毒疫苗方法，其特征在于，质粒合成步骤中，合成tffTlin pUC57-Amp 质粒或(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl) in pUC57_Amp 质粒，其核苷酸序列分别如SEQ N0.5、SEQ N0.6所示。
7.如权利要求5所述的制备腺病毒疫苗方法，其特征在于，重组腺病毒载体构建步骤中，采用限制性内切酶酶切pUC57-Amp质粒或(GM-CSF) -P2A- (IL-4) -F2A- (WTl)inpUC57-Amp质粒，将目的基因克隆入pAdC68载体内，构建病毒载体；优选的，所述的限制性内切酶为Xba I和Kpn I酶。
8.如权利要求5所述的制备腺病毒疫苗方法，其特征在于，重组腺病毒的制备和鉴定步骤中，将所述病毒载体转入HEK293细胞中，并酶切鉴定。
9.一种如权利要求1-4中所述腺病毒疫苗的在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。
【专利摘要】本发明公开了一种用于预防和治疗高表达WT1肿瘤的黑猩猩腺病毒疫苗，给出了治疗乳腺癌的新手段，选择Wilm’s瘤基因1(WT1)作为靶点，黑猩猩腺病毒作为载体，应用重组表达WT1和(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WT1)的黑猩猩腺病毒疫苗成功的预防和延长了乳腺癌小鼠的生存期，为该疫苗的临床应用提供了实验基础，对其他肿瘤的治疗具有提示作用。
【IPC分类】A61K48-00, A61K39-235, A61P35-00
【公开号】CN104784702
【申请号】CN201510176121
【发明人】冯晓明, 周东明, 邢曼, 吴万通, 罗悦晨, 方春敏
【申请人】中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月14日
文档序号 :
【 8463916 】
技术研发人员：冯晓明,周东明,邢曼,吴万通,罗悦晨,方春敏
技术所有人：中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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