链球菌组合疫苗的制作方法
链球菌组合疫苗本发明涉及用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗，链球菌用于制造此类疫苗的用途，用于制备此类组合疫苗的方法和包含此类疫苗的各部分组成的试剂盒(kit-of-parts)。经过过去数十年，全世界范围可见鱼类消耗的大量增加。这是关于冷水鱼例如鲑鱼、比目鱼、大比目鱼和鳕鱼，以及热带鱼例如亚洲海鲈、罗非鱼、遮目鱼、黄尾鱼、琥珀鱼、石斑鱼和军曹鱼的情况。因此，已见养鱼场的数目和大小的增加，以便满足渐增的市场需要。
如由例如畜牧业已知的，紧密生活在一起的大量动物易受各种各样的疾病影响，甚至是几乎不知道或没见过的疾病，或甚至是在大规模商业养殖前未知的疾病。这对于鱼类养殖同样是真实的。众人皆知的商业上重要的鱼病原体的例子是鳗弧菌(KiArio anguillarum)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种 iPhotobacterium damseIae subspecies piscicit/a )、海洋屈接杆菌(Tonaci baculum mari timum )、黄杆菌属物种{Fla vobac teri um sp.)、屈接杆菌属物蜗 iFlexibacter sp.)、链球菌属物种(Stre/ sp.)、格氏乳球菌
)、迟钝爱德华氏菌iEchmrdsiella (art/a)、It鱼爱德华氏菌iE. ictaluri)、病毒性坏死病毒、虹彩病毒和锦鲤疱疫病毒。细菌链球菌属的几个物种目前已知在鱼中更具体而言在水产业中饲养的鱼中引起感染。此类链球菌属物种的例子是海豚链球菌〔Streptococcus ifliae)、难辨链球菌(5
无乳链球菌(51 aga/actiae)、停乳链球菌(51 dysgalactiae)和海豹链球菌(51. phocae、。近来在关于难辨链球菌和无乳链球菌的正确命名法的意见中已存在某些变化。Vandamme 等人(Int. J. Syst. Bacteriology 47:81-85 (1995))已建议难辨链球菌事实上是非溶血性无乳链球菌。海豚链球菌在罗非鱼、虹鳟、欧洲海鲈和鳊、亚洲海鲈、眼斑拟石首鱼、河豚、牙鲆、黄尾鱼和杂交柳鲈中频繁发现。海豚链球菌感染对水产业的影响每年超过100，000，000美
J Li o难辨链球菌在罗非鱼、鲷鱼和甚至鳐鱼中频繁发现。尽管在许多鱼物种中发现，但无乳链球菌目前主要发现感染罗非鱼。用于对抗鱼中的链球菌感染的疫苗是本领域已知的。许多链球菌疫苗基于被杀死的全细胞。无乳链球菌疫苗例如在美国专利申请US2005/0208077中描述。海豚链球菌疫苗例如在美国专利US 6，379，677中描述。用于对抗海豚链球菌感染的疫苗也是商购可得的。例子是Norvax Strep Si，针对海豚链球菌感染且由 Intervet Int. B. V.销售的疫苗。Eldar 等人(Vaccine 13:867-870 (1995))已描述了基于被杀死的全细胞针对难辨链球菌的疫苗。为了改善在热带鱼中更具体而言在罗非鱼中的链球菌疾病的了解，本发明人已在亚洲和拉丁美洲中的主要罗非鱼生产国家中J进行了广泛流行病学调查。经过过去8年，这些研究已获得从13个国家中约50个场所回收的几乎500个链球菌分离物。使用标准生物化学和细菌学鉴定法已鉴定了分离物，并且随后通过聚类(cluster)分析进行分析(基于差异百分比的未加权对组平均值)。有趣的是，从罗非鱼中回收的几乎500个链球菌分离物中，82 %鉴定为无乳链球菌，并且18 %鉴定为海豚链球菌。海豚链球菌是在热带和亚热带地区中的许多海洋和淡水培养的鱼物种中引起疾病和死亡率的重要鱼病原体。在多种鱼物种包括罗非鱼中对抗海豚链球菌感染的疫苗是可获得的，并且存在关于这种生物在多种鱼物种中的致病机理的大量文献。对于鱼致病性无乳链球菌可获得少得多的信息。无乳链球菌是所谓的B组链球菌(GBS)。它是人和动物的重要病原体。尽管与人和牛宿主中的疾病通常更相关，但鱼致病性无乳链球菌早至1966年已得到证明，当时非溶血性B组链球菌鉴定为金体美洲鳊鱼(美洲鳊鱼iNotemigonus c/yso/eycas))中的2种动物流行病的原因。
今天，随着水产业的加强，无乳链球菌已知是海产和淡水培养物种且特别是罗非鱼中的死亡率和发病率的重要原因。如通过本发明人发现的，罗非鱼无乳链球菌分离物的详细分析表明在多种生物化学和表型特征中不同的2个独特簇的存在。这些独特簇称为生物型，并且在这个基础上，可以在‘经典’无乳链球菌(下文称为无乳链球菌生物型I)和一般地非3溶血性无乳链球菌(下文称为无乳链球菌生物型2)之间做出区分。这后一种菌株先前鉴定为难辨链球菌(5 difficile IS. difficilis )，但随后已重新分类为无乳链球菌的非-￠-溶血性变体。在养殖的罗非鱼中的无乳链球菌感染目前已知导致显著发病率、死亡率和经济损失。无乳链球菌的感染导致多种内脏器官特别是脑的败血病和建群(colonization)，导致临床症状。无乳链球菌感染的临床体征包括异常游泳、‘C’形体位和食欲不振。无乳链球菌在温带和热带地区各处流行，并且本发明人已从在欧洲、中美洲和拉丁美洲和亚洲各处的患病罗非鱼中回收到它。2个无乳链球菌生物型引起细微不同的疾病综合征，其中生物型I感染从幼年到成年的生产周期各处的鱼，而生物学2占优势地在较大的鱼中引起疾病。在迄今为止本发明人的流行病学调查中，对于来自13个国家的几乎500个链球菌分离物，罗非鱼的所有链球菌分离物中的大多数是无乳链球菌生物型2。本发明人已在来自主要罗非鱼生产国家的大多数的患病鱼中鉴定了无乳链球菌生物型2，所述国家包括印度尼西亚、中国、越南、菲律宾、厄瓜多尔、洪都拉斯、墨西哥和巴西。从鱼中分离的生物型I菌株的分析揭示存在2个血清型血清型Ia菌株和血清型III 菌株(Suanyuk, N.等人，Aquaculture 284:35-40 (2008))。然而，2个菌株共有使得其成为生物型I菌株的相同生物化学特征，并且它们都是溶血性的。最重要的是，2个菌株含有编码表面结合的a-C蛋白质的基因Oca)。对于这种蛋白质，在1991年已广泛显示它诱导针对无乳链球菌的保护性免疫(Michel，J. L.等人，Inf.& Immun. 59 :2023-2028 (1991))。甚至产生了针对B组链球菌中的特异性保护性a -C蛋白质表位的单克隆抗体，其能够杀死 B 组链球菌(Madoff，L. C.等人，Inf. & Immun. 59 :204-210 (1991))。
a -C蛋白质通常在无乳链球菌血清型Ia菌株中发现，但在人无乳链球菌血清型III菌株的表面上不常见。然而，结果是它通常存在于迄今为止分离的所有鱼病原性无乳链球菌血清型III菌株的表面上。因此，可以确实地得出结论基于例如Mullet分离物Ia血清型的血清型的现有全细胞疫苗，能够诱导针对已知的无乳链球菌血清型Ia菌株和近期以来发现的无乳链球菌血清型III菌株的保护性免疫应答。目前令人惊讶地发现，尽管其具有相关的(joined)生物型、具有相关的P-溶血性特征和具有相关的表面结合的a-C蛋白质，但基于已知Mullet (Ia)菌株的全细胞疫苗的确仅提供针对近期以来发现的无乳链球菌血清型III菌株的部分保护，并且反之亦然。这个出乎意料的发现迄今为止仍是被忽视的。同样出乎意料的后果是目前疫苗不足以有效避免或治疗鱼中的无乳链球菌感染。 本发明的目的之一是通过提供用于保护鱼不受无乳链球菌感染的组合疫苗，提供针对这个问题的解决方案，所述组合疫苗具有它包含免疫原性量的2个无乳链球菌生物型I菌株的特征一个属于血清型Ia并且一个属于血清型III。本发明的第一个实施方案因此涉及用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗，其中所述疫苗包含免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞和药学可接受的载体。免疫原性量的无乳链球菌细胞是引起免疫应答所需的量，与未接种疫苗的鱼比较，其至少能够减少疾病的严重度。药学可接受的载体可以与水或缓冲剂或乳状液或水包油或油包水乳状液一样简单。尽管无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和无乳链球菌生物型I血清型III细胞对于技术人员是可容易获得的，但无乳链球菌血清型III菌株的例子已在登记号CNCM1-4232下于2009年10月15日保藏于国立微生物保藏中心(法国)，巴斯德研究院，DocteurRoux 大街 25 号，F-75724 巴黎邮编 15,法国(Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms (CNCM), Institut Pasteur,25 Rue du Docteur Roux, F-75724 ParisCedex 15，France)，具有英特维特国际股份有限公司，维姆科沃尔街35号，5831 AN，博克斯梅尔，荷兰(Intervet International B. V. , Wim de Korverstraat 35,5831 AN,Boxmeer, The Netherlands)的名称和地址。在根据本发明的组合疫苗中，细菌可以以活减毒形式或以灭活形式例如作为菌苗(bacterin)存在。重要的是细菌的免疫原性性质仍存在的事实。这可以通过使用全细菌制剂容易地确保。如上所述，只要细菌的免疫原性性质仍存在，制剂中的细菌是活的、被杀死的或甚至成碎片的(fragmented)(例如通过按压其经过弗氏压碎器)并不是非常重要的。活减毒的细菌是非常合适的，因为它们确定携带免疫原性特征。并且活减毒的细菌具有超过菌苗的优点，它们可以无需佐剂而容易地被给予。此外，它们自我复制至一定程度，直至它们被免疫系统停止，因此可以给予较低数目的细胞。另一方面，当这些细菌以菌苗的形式时，免疫原性特征还存在于细菌上。并且菌苗具有超过活减毒的细菌的优点，因为它们是非常安全的。因此，在这个实施方案的优选形式中，本发明涉及其中无乳链球菌细胞是灭活的组合疫苗。优选地，细胞以菌苗的形式。菌苗在此处定义为以灭活形式的细菌。用于灭活的方法看起来对于菌苗的活性是不相关的。用于灭活的常规方法例如都是本领域众所周知的热处理，用福尔马林、二乙烯亚胺、硫柳萊等处理是可应用的。使用例如弗氏压碎器(French Press),借助于生理应激的细菌灭活提供了用于制造根据本发明的疫苗的同样合适的原材料(starting material)。根据本发明的疫苗可以根据熟练从业者众所周知的技术由细菌培养物开始制备。涉及鱼疫苗及其制造的综述文章例如Sommerset, I. , Kross0y, B. , Biering, E.和Frost,P. in Expert Review of Vaccines 4 :89-101 (2005)；Buchmann,K. ,Lindenstrom,T. ^PBresciani, in J. Acta Parasitologica 46 :71-81 (2001), Vinitnantharat, S.,Gravningen, K.和 Greger,E. in Advances in veterinary medicine 41 :539-550 (1999)和 Anderson, D. P. in Developments in Biological Standardization 90 :257-265 (1997)。 此外，熟练从业者将在下文实施例中找到指导。根据本发明的疫苗基本上包含有效量的细菌和药学可接受的载体。施用的细胞量将取决于施用途径、佐剂的存在和施用时刻。另外，本领域技术人员在上文提及的参考文献和下文给出的信息特别是实施例中发现足够指导。一般来说，基于菌苗的根据本发明制造的疫苗一般而言可以通过注射进行施用，其剂量为IO3 - 10'优选IO6 - 10'更优选IO8 - 101°个细菌。尽管是免疫学合适的，但由于商业原因，超过101°个细菌的剂量将是较少吸引力的。对于根据本发明制造和用于经口应用的疫苗中的细菌量，下文的例子将提供充分指导。适合于在用于根据本发明的疫苗中使用的药学可接受的载体例子是无菌水、盐水、水性缓冲液例如PBS等。此外，根据本发明的疫苗可以包含其他添加剂，例如如下所述的佐剂、稳定剂、抗氧化剂及其他。在优选呈现中，根据本发明的疫苗特别是包含菌苗的疫苗可以还含有免疫刺激物质，所谓的佐剂。一般而言，佐剂包含以非特异性方式加强宿主的免疫应答的物质。许多不同佐剂是本领域已知的。通常用于鱼和甲壳类动物养殖中的佐剂例子是胞壁酰二肽、脂多糖、几种葡聚糖和聚糖和Carbopol (R)0适合于鱼和甲壳类动物疫苗的佐剂的广泛概述在通过 Jan Raa (Reviews in Fisheries Science 4 (3):229-288 (1996))的综述文件中给出。疫苗还可以包含所谓的“媒介物”。媒介物是细菌与之附着而无需与之共价结合的化合物。此类媒介物是例如生物微胶囊、微海藻酸盐、脂质体和macrosoI s，都是本领域已知的。其中抗原部分包埋到媒介物中的特别形式的此类疫苗是所谓的ISCOM (欧洲专利EP 109. 942、EP 180. 564、EP 242.380)。此外，疫苗可以包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂例如Span或Tween0适合于在油包水乳剂中使用的油佐剂是例如矿物油或可代谢油。矿物油是例如Bayo I 、Marco I 和 Drakeo I 。非矿物油佐剂的例子是例如Montanide-ISA-763-A。可代谢油是例如植物油例如花生油和大豆油，动物油例如鱼油角鲨烷和角鲨烯，和生育酚及其衍生物。合适的佐剂是例如w/o乳状液、o/w乳状液和w/o/w双重乳状液。基于水的纳米颗粒佐剂的例子是例如Montanide-IMS-2212。通常，将疫苗与稳定剂混合，例如以保护有降解倾向的蛋白质不被降解，增强疫苗的保存期限，或改善冷冻干燥效率。有用的稳定剂是例如SPGA (Bovarnik等人；J.Bacteriology 59 :509 (1950))，碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖，蛋白质例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，和缓冲剂例如碱金属磷酸盐。
此外，疫苗可以悬浮于生理学可接受的稀释剂中。不用说，佐剂化、加入媒介物化合物或稀释剂、乳化或稳定化蛋白质的其他方式也在本发明中体现。已知当作为油包水乳状液给予时,特别是灭活疫苗例如菌苗显示改善的免疫原性。因此，在这个实施方案的更优选形式中，本发明涉及其中疫苗是油包水乳状液的
组合疫苗。从药学可接受性的观点来看，越来越不愿意使用矿物油。因此，在这个实施方案的更加优选形式中，本发明涉及其中油是非矿物油的组合疫苗。在这个实施方案的最优选形式中，本发明涉及其中油是Montanide ISA 763 A的
组合疫苗。可以应用许多施用方式，其都是本领域已知的。根据本发明的疫苗优选经由注射、浸入、浸溃或经口施用于鱼。特别地经口应用和例如腹膜内应用是有吸引力的施用方式。一般来说如果疫苗可以通过加入佐剂得到改善，那么施用方式将优选是腹膜内途径。从免疫学观点来看，用菌苗的腹膜内疫苗接种是非常有效的疫苗接种途径，特别是因为它允许佐剂的掺入。施用方案可以依据标准疫苗接种实践进行最佳化。技术人员将了解如何做到这点，或他将在上述文件中找到指导。待接种疫苗的鱼的年龄并不是关键的，尽管明确的是希望在尽可能早的阶段，SP在可能暴露于病原体前，进行针对鱼致病性细菌的疫苗接种。然而，极小鱼的疫苗接种是困难和耗时的。一般来说，如果需要或希望的话，自5克以上的鱼可以借助于注射进行疫苗接种。对于经口施用，疫苗优选与用于经口应用的合适载体混合，所述载体即纤维素、食物或可代谢的物质例如a-纤维素或植物或动物起源的不同油。同样，有吸引力的方式是疫苗施用至高浓度活饲料生物，随后将活饲料生物喂给靶动物例如鱼。用于根据本发明的疫苗的经口递送的特别优选的食物载体是能够包装疫苗的活饲料生物。合适的活饲料生物包括浮游生物样非选择性滤食动物(filter feeder)，优选轮虫的成员、卤虫等。高度优选的是海奸卤虫属物种。如下根据实施例，无乳链球菌生物型I和无乳链球菌生物型2之间的交叉保护水平很低，或是不存在的。因此，根据本发明另一种优选形式的组合疫苗另外包含免疫原性量的无乳链球菌生物型2细胞、免疫原性量的无乳链球菌生物型2细胞的抗原或编码此类抗原的遗传材料。此外，根据本发明的疫苗将获益于免疫原性量的海豚链球菌细胞、免疫原性量的海豚链球菌的抗原或编码此类抗原的遗传材料的另外存在。因此，根据本发明的再次另一种优选形式的组合疫苗另外包含免疫原性量的海豚链球菌细胞、免疫原性量的海豚链球菌的抗原或编码此类抗原的遗传材料。明确的是，根据本发明的疫苗还将获益于用于制造疫苗的另一种免疫原性量的另一种鱼致病性微生物或鱼致病性病毒、此类微生物或病毒的抗原或编码此类抗原的遗传材 料的存在。因此，第一个实施方案的另一种优选形式涉及根据本发明的组合疫苗，其中所述疫苗另外包含免疫原性量的另一种鱼致病性微生物或鱼致病性病毒、此类微生物或病毒的抗原或编码此类抗原的遗传材料。优选地，所述其他微生物或病毒选自下述鱼病原体鳗弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、海洋屈挠杆菌、黄杆菌属物种、屈挠杆菌属物种、格氏乳球菌、迟钝爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、停乳链球菌、病毒性出血败血症病毒、病毒性坏死病毒、虹彩病毒、鲤鱼跳跃病毒血症和锦鲤疱疫病毒。因此，以更优选的形式，其他微生物或病毒选自下述鱼病原体鳗弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、海洋屈挠杆菌、黄杆菌属物种、屈挠杆菌属物种、格氏乳球菌、迟钝爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、停乳链球菌、病毒性出血败血症病毒、病毒性坏死病毒、虹彩病毒、鲤鱼跳跃病毒血症和锦鲤疱疫病毒。本发明的另一个实施方案涉及免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞用于制造用于保护鱼不受链球菌感染的疫苗的用途。本发明的另外一个实施方案涉及用于制备根据本发明的组合疫苗的方法，其中那种方法包含混合免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞和药学可接受的载体的步骤。本发明的再次另一个实施方案涉及各部分组成的试剂盒，其具有它包含至少2个小瓶的特征，其中这些小瓶一起包含免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞和药学可接受的载体。此类各部分组成的试剂盒例如还包括包含至少2个小瓶的各部分组成的试剂盒，其中一个小瓶包含免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞，并且另一个小瓶包含生物型2细胞和药学可接受的载体。实施例
实施例I
疫苗接种 疫苗疫苗-I :TI1428无乳链球菌生物型1，血清型III，也称为Sal (X)
药物形式油包水30%水相和70% Montanide ISA 763油 抗原浓度以I. 36E+8细胞/ml的无乳链球菌I (X)
疫苗-2 :TI 1422无乳链球菌生物型1，血清型Ia，也称为Sal (Y)
药物形式油包水30%水相和70% Montanide ISA 763油 抗原浓度以I. 36E+8细胞/ml的无乳链球菌I (Y)
标准疫苗稀释
权利要求
1.用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞和药学可接受的载体。
2.根据权利要求I的组合疫苗，其特征在于所述无乳链球菌细胞是灭活的。
3.根据权利要求I或2的组合疫苗，其特征在于所述疫苗是油包水乳状液。
4.根据权利要求3的组合疫苗，其特征在于所述油是非矿物油。
5.根据权利要求4的组合疫苗,其特征在于所述非矿物油是MontanideISA 763。
6.根据权利要求1-5的组合疫苗，其特征在于所述疫苗另外包含免疫原性量的无乳链球菌生物型2细胞、免疫原性量的无乳链球菌生物型2的抗原或编码此类抗原的遗传材料。
7.根据权利要求1-5的组合疫苗，其特征在于所述疫苗另外包含免疫原性量的海豚链球菌细胞、免疫原性量的海豚链球菌的抗原或编码此类抗原的遗传材料。
8.根据权利要求1-7的组合疫苗，其特征在于所述疫苗另外包含免疫原性量的另一种鱼致病性微生物或鱼致病性病毒、此类微生物或病毒的抗原或编码此类抗原的遗传材料。
9.根据权利要求8的组合疫苗，其特征在于所述另一种微生物或病毒选自下述鱼病原体鳗弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、海洋屈挠杆菌、黄杆菌属物种、屈挠杆菌属物种、格氏乳球菌、迟钝爱德华氏菌、鲶鱼爱德华氏菌、停乳链球菌、病毒性出血败血症病毒、病毒性坏死病毒、虹彩病毒、鲤鱼跳跃病毒血症和锦鲤疱疫病毒。
10.免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞用于制造用于保护鱼不受链球菌感染的疫苗的用途。
11.用于制备根据权利要求1-9的组合疫苗的方法，其特征在于所述方法包含混合免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的难辨链球菌生物型I血清型III细胞和药学可接受的载体的步骤。
12.各部分组成的试剂盒，所述试剂盒的特征在于它包含至少2个小瓶，所述小瓶一起包含免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型Ia细胞和免疫原性量的无乳链球菌生物型I血清型III细胞和药学可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及用于保护鱼不受链球菌感染的组合疫苗，链球菌用于制造此类疫苗的用途，用于制备此类组合疫苗和包含此类疫苗的各部分组成的试剂盒的方法。
文档编号A61K39/09GK102740878SQ201080047156
公开日2012年10月17日 申请日期2010年10月18日 优先权日2009年10月19日
发明者B.舍汉, L.拉布里, W.F.仙, Y.S.李 申请人:英特维特国际股份有限公司
文档序号 :
【 1005783 】
技术研发人员：L.拉布里,B.舍汉,Y.S.李,W.F.仙
技术所有人：英特维特国际股份有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：L.拉布里,B.舍汉,Y.S.李,W.F.仙
技术所有人：英特维特国际股份有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除