一种仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种仿生物特异性免疫吸附材料，特别是涉及ー种可用于血液浄化的仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法。本发明涉及采用点击化学(click chemistry)的方法实现载体与配基的偶联，制备仿生物特异性免疫吸附材料，。
背景技术：
免疫吸附(immunoadsorption)疗法是ー种基于亲和层析原理以实现血液净化的ー种新技术，用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。它是将对某些具有专一而可逆亲和力的生物活性分子作为配基与载体结合，制成吸附柱，利用其特异吸附性能，特异性地清除患者血液中的致病因子，从而达到净化血液，预防及治疗疾病的目的。自1979年Terman首次报道用DNA免疫吸附剂血液灌流治疗一例重度系统性红斑狼疮患者获得成功后，免疫吸附疗法日益受到临床医学的重视。·
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对免疫吸附疗法的疗效起决定性作用的是免疫吸附材料(也称为免疫吸附剂)。目前，国外临床应用的免疫吸附材料主要是以蛋白A为配基的吸附材料，它可以清除患者体内的IgG等致病因子。蛋白A吸附材料自从上世纪80年代应用于自身免疫性疾病治疗以来，它对多种疾病的治疗有效性已经得到证实，并获得美国FDA批准，成为多种自身免疫性疾病的推荐疗法。但是，蛋白A吸附材料也存在一些缺陷，限制了它的广泛使用。首先，蛋白A价格高昂，占蛋白A免疫吸附材料成本的80%左右，给普通患者带来了极其沉重的经济负担；其次，蛋白A作为ー种蛋白质配基，稳定性不高，容易变性，为吸附材料的生产、运输、保存和使用带来不便；其三，蛋白A是ー种蛋白质大分子，如果治疗过程中出现脱落则会给患者安全带来风险。因此，如何克服蛋白A吸附材料的这些缺陷，设计和制备既具有与蛋白A吸附材料相当的免疫吸附效率，又具有稳定的物理化学性质和相对低廉的成本的新型免疫吸附材料，具有重要的研究价值和现实意义。与蛋白A类生物大分子相比，化学合成的小分子化合物在成本和物理化学稳定性上都具有显著优势，故很多研究着眼于筛选和设计具有仿生物亲和作用的小分子配基，即模拟生物特异性配基或仿生配基(pseudobiospecific ligand),进而研究以这类小分子物质为配基的IgG吸附材料。在这些仿生配基中，氨基酸由于其无毒，价廉和对IgG的高选择性已代替蛋白质用于亲和色谱方面。有报道证明氨基酸能高效地从人血浆或血清中分离出IgG。然而，目前所研究的这类非蛋白A类的免疫吸附材料在实际应用中还不能达到与蛋白A吸附材料相当的分离或治疗效果。其主要原因在于吸附材料与抗体的结合力和选择性上还不够理想。因此，如何在降低成本的同时，提高吸附材料与抗体的结合能力和选择性对于设计和制备吸附性能与蛋白A吸附剂相当的新型免疫吸附材料是ー个非常重要的问题。作为免疫吸附材料的载体-配基复合物，其制备过程一般包括两个基本过程载体活化以及活性载体与配基的偶联。在免疫吸附材料的制备过程中，多糖基载体活化最通常的方法是先将其羟基氧化后，接上ニ胺类间隔臂，再经醛化(一般用戊ニ醛)生成希夫碱；然后，还原成烷胺键化合物。经活化的活性载体直接与未经修饰的配基通过烷胺键偶联。该制备方法中，活化步骤繁琐，且经过多步活化反应后，载体的总活化率大大降低。而且烷胺键对蛋白A的反应选择性并不高。因此，活性载体与配基之间的反应不具有高选择性和高效性，从而极大地影响了免疫吸附材料的吸附性能。
发明内容
本发明的第一目的g在提供ー种安全、有效、成本低廉，性能稳定可靠的仿生物特异性免疫吸附材料。本发明第二目的是提供上述仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法。本发明第三个目的在于提供上述仿生物特异性免疫吸附材料在IgG分离中的应用。本发明以含有丰富羟基，血液相容性和机械性能良好的琼脂糖凝胶为载体，以廉价、稳定、易于保存和消毒的氨基酸为仿生配基，采用ー种高效、高选择性的方法-点击化学设计和制备ー种对IgG具有高选择性，且成本低廉，性能稳定可靠，效果与蛋白A吸附材料相当的仿生物特异性免疫吸附材料。点击化学(Click Chemistry)于2001年由诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless提出，指那些最佳的化学反应。这些反应的活性组件衍生于烯烃和炔烃，绝大部分反应涉及碳-杂原子键的形成；反应易于操作，对空气和水不敏感，井能高产率生成目标产物，很少甚至没有副产物，而且不会受相连在一起的其他官能团影响，即反应具有选择性。最广泛使用的点击反应是Cu ( I )催化的Huisgen 1，3-偶极环加成反应，即叠氮化合物和炔基化合物反应都能生成含有三唑的化合物。由于点击化学可以在不同的分子和材料间有效地实现共价连接，叠氮基和端基炔彼此间有非常高的选择性，因而能高产率地生成目标产物。所生成的反应物在生理条件下的惰性及温和的反应条件为体内、体外生物的应用提供了极大的便利，如其在生物耦联方面的应用越来越广泛。本发明的目的通过如下技术方案实现ー种仿生物特异性免疫吸附材料，具有如下的化学结构
权利要求
1.一种仿生物特异性免疫吸附材料，其特征在于具有如下的化学结构
2.权利要求I所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件 Ca)叠氮化琼脂糖凝胶的制备 向环氧化琼脂糖中加入叠氮化钠的水溶液，每克环氧化琼脂糖中加入叠氮化钠3 15mmol，20 60° C反应6 60h后，洗涤抽干得产物； (b)炔酸的合成 将丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇于一 10 10° C下混合，丁二酸酐与炔丙醇的摩尔比为I 3 I ;然后加入催化剂4-二甲氨基吡啶及缚酸剂三乙胺或吡啶，催化剂、缚酸剂与炔丙醇的摩尔比为0.01 O. I O. I I. O 1，保温反应O. 5 3h后回流12 72h，洗涤干燥得炔酸； (c)制备炔酸的活性酯 将所述炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1，4- 二氧六环后，加入缩合剂N，N' -二环己基碳二亚胺并于一 10 10° C下保温反应0.5 3h后，升温至20 60° C反应12 72h，过滤、旋蒸，并进行柱层析纯化得炔酸的活性酯；其中N-羟基丁二酰亚胺、N，N' -二环己基碳二亚胺与炔酸的摩尔比为I 3 : I 3 : I; (d)炔化氨基酸的合成 将炔酸的活性酯溶于1，4-二氧六环后与配基的水溶液混合；用碳酸钠溶液或三乙胺调pH至9. O 12. O,然后于20 80° C反应12 72h ;反应完毕以盐酸或饱和柠檬酸水溶液调混合液的pH至2. O 5. 0，再用乙酸乙酯及水萃取后进行柱层析纯化得产物；其中氨基酸与炔酸的活性酯的摩尔比为I 3 : I ;所述配基为L-组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸； Ce)点击反应制备免疫吸附材料 将炔化氨基酸的溶液加入叠氮化琼脂糖中，每克叠氮化琼脂糖加入3 IOmmol炔化氨基酸，然后依次加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂，五水硫酸铜、抗坏血酸钠与炔化氨基酸的摩尔比为O. 01 O. 05 O. 02 O. I I;混合物于20 80。C反应12 72h后，洗涤抽干得产物。
3.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于所述环氧化琼脂糖通过如下方法制备按每克琼脂糖凝胶加入2mL环氧氯丙烷和I 2mL氢氧化钠溶液的比例，将琼脂糖凝胶、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液混合后室温下搅拌反应3 4h，以水洗涤，抽干直到在洗涤液中加入I. 3M硫代硫酸钠后酚酞不变红为止，即得环氧化琼脂糖；所述氢氧化钠溶液的浓度为I. 5 3M。
4.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于所述丁二酸酐溶于二氯甲烷中，每Immol 丁二酸酐中二氯甲烷加入量为O. 5^2. 5mL。
5.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于所述炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1，4- 二氧六环中，每Immol炔酸中1，4- 二氧六环的加入量为 O. 2 I. OmL。
6.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于所述炔酸的活性酯溶于1，4_ 二氧六环中，每Immol炔酸的活性酯中1，4-二氧六环的加入量为O.5 2. 5mL0
7.根据权利要求2所述的仿生物特异性免疫吸附材料的制备方法，其特征在于所述炔化氨基酸溶于DMF或1，4- 二氧六环中，每Immol炔化氨基酸中DMF或1，4- 二氧六环的加入量为I. 0 3. OmL。
8.权利要求I所述的仿生物特异性免疫吸附材料在IgG分离中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种仿生物特异性免疫吸附材料及其制备方法与应用。制备时，先通过环氧化琼脂糖与叠氮化钠反应得叠氮化琼脂糖凝胶；将丁二酸酐溶于二氯甲烷后和炔丙醇，加入催化剂，制得炔酸；将炔酸和N-羟基丁二酰亚胺溶于1，4-二氧六环后，加入缩合剂，制得炔酸的活性酯，将炔酸的活性酯溶于1，4-二氧六环后与配基的水溶液混合，制得炔化氨基酸，将炔化氨基酸的溶液加入叠氮化琼脂糖中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠作催化剂，制得产物。本发明以含有丰富羟基，血液相容性和机械性能良好的琼脂糖凝胶为载体，合成步骤简单、制备安全；产品具有特异性强、对IgG的吸附效率高、再生性能好的特性，可用于IgG分离和临床上免疫吸附治疗。
文档编号B01J20/26GK102671638SQ20121015239
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者李光吉, 胡小艳 申请人:华南理工大学
文档序号 :
【 5027117 】
技术研发人员：李光吉,胡小艳
技术所有人：华南理工大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：李光吉,胡小艳
技术所有人：华南理工大学
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