人白细胞介素-2蛋白质的制备方法
【专利摘要】一种人白细胞介素2(IL-2)蛋白质的制备方法，通过在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类白细胞介素-2(IL-2)基因进行制备，其步骤如下：IL-2基因的克隆、IL-2蛋白表达筛选、IL-2蛋白质纯化以及IL-2内毒素检测。本发明的方法可以大剂量提纯精制其表达的融合蛋白产物，可进行严格的质量控制且有着非常强的实用性。
【专利说明】人白细胞介素-2蛋白质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程【技术领域】，尤其涉及一种白细胞介素_2蛋白质的制备 方法，该方法采用在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类DNA制备蛋白的技术，具有通 用性，特别是表达的质粒设计。
【背景技术】
[0002] 人白细胞介素-2,简称人白介素-2,英文简称IL-2,又名T细胞生长因子，英文简 写为TCGF。人白介素-2早在1976年就被发现在激活的淋巴细胞的培养液中，人的蛋白序 列的在1983年得以确定，是由153个氨基酸构成，其中含有20的氨基酸的信号肽在N端。 T淋巴细胞受到抗原或有丝分裂原的刺激释放由133个氨基酸组成的分子量为16kDa的糖 基化白介素-2蛋白，历经三十多年的研究，人白介素_2分子通过它的受体调节T淋巴细胞 的形成和平衡，在肿瘤治疗中起着非常关键的作用。目前的蛋白质制备，在全球范围内多数 是把重组人类DNA表达在细菌内，然后从细菌里制备其表达的蛋白。其好处是成本低方法 简单容易，但缺点是制备的蛋白有诸多方面的缺欠。人类蛋白应该在人类细胞中制备以符 合人类自身的需求，但方法难、产量低一直困扰着人们对它的渴求，本方法可以大量制备在 人类细胞中表达的IL-2人类蛋白，可以进行质量控制，有着极强的实用性。
【发明内容】
[0003] 本发明突破了重组人类DNA在人类细胞中表达制备蛋白质产量低的技术瓶颈，提 供了质粒结构的设计和制备方法。通常的方法在1升的培养液中只能制备出不到1毫克的 IL-2蛋白，本发明可高达57. 6毫克，方法可行，质量可控，实用性极强。
[0004] 因此，本发明的目的是提供一种可进行严格的质量控制且有非常强的实用性的人 白细胞介素-2蛋白质的制备方法。
[0005] 为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种人白细胞介素-2(IL_2)蛋白质的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 1)IL_2基因的克隆
[0008] 先通过PCR扩增连接物（KSS)和IL-2片段，然后利用琼脂糖凝胶回收PCR片段 KSS和IL-2,与pTT5连接、转染到细菌内，经培养挑取菌落做PCR，根据PCR结果测序，最后 将正确的PTT5-KSS-IL-2进行克隆，提取质粒；
[0009] 2) IL-2蛋白质表达筛选
[0010] 先进行人类胚肾细胞293F细胞瞬时转染优化实验，通过测定其蛋白在瞬时转染 293F细胞中的表达量，筛选出高表达的条件，进行IL-2蛋白的表达；
[0011] 3)IL-2蛋白质的纯化精制
[0012] 对目标IL-2蛋白质进行分离纯化，并对其进行定量分析；
[0013] 4)IL_2内毒素检测
[0014] 将步骤3)中纯化后的IL-2进行内毒素含量的检测。
[0015] 进一步地，所述步骤1)中PCR扩增KSS片段和IL-2片段所用的引物为：IL-2_1F， 序列如 SEQ ID N0:1 所示，IL-2-1R，序列如 SEQ ID N0:2 所示，IL-2-2F，序列如 SEQ ID N0:3所示，IL-2-2R，序列如SEQ ID N0:4所示以及表达质粒的设计中引物为：人工序列 PTT5-KSS-IL-2,序列如 SEQ ID NO :5 所示。
[0016] 进一步地，所述步骤1)中所述PCR反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后 进行98°C变性30s、65°C复性30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C 延伸IOmin后保存于16°C。
[0017] 进一步地，步骤1)中连接和转化pTT5-KSS-IL-2的步骤是将pTT5、KSS、IL-2、5X Enzyme Buffer以及IOX Enzyme Mix的连接反应体系混勻，在室温下放置30min，将感受态 细胞置于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min ; 然后在42°C下准确热激30s，立刻立即转移至冰上放置2min ;再加入250ul室温的SOC培 养基，在37°C，200rpm的条件下孵育Ih ;最后取IOOul细胞均匀涂布于LB平板（100ug/ml Amp)上，在37°C培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
[0018] 进一步地，步骤1)中琼脂糖凝胶电泳检测菌落通过PCR结果进行显示，所用引物 为PTT5-F和pTT5-R，所述的PCR反应条件为：在体系1中94°C预变性IOmin后进行94°C变 性30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸IOmin 后保存于16 C。
[0019] 进一步地，所述步骤2)中以最佳IL-2蛋白进行表达的步骤是先对人类胚肾细胞 293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须> 90% ;然后将所述的293F细胞 密度调整至IX 1〇6,接种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为分 别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺（PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三角细 胞培养；最后将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37°C，二氧化碳浓度8%， 摇床转速17〇rpm/min的条件下,培养7天,收细胞悬液,进行蛋白纯化。
[0020] 进一步地，步骤3)中所述的分离纯化步骤是先将层析系统和层析柱处理好，然后 再进行层析纯化，通过电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在 4°C条件下离心40min，采用0. 22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。
[0021] 进一步地，步骤4)中所述的内毒素检测步骤是先取IOOul准备好的标准品和样品 用加到去内毒素的管中，加 IOOul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37°C恒温孵 箱中45min ;然后加 IOOul显色基质到每个管中，混匀，放入37°C恒温孵箱中6min ;再加不 同的500ul颜色稳定剂到每个管中，混匀；最后从每个管中取IOOul液体加到酶标板中，用 读板机在545nm的波长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
[0022] 由于采用以上技术方案，本发明的有益效果包括：
[0023] 本发明提供的人白细胞介素_2蛋白质的制备方法是可以在人类胚肾细胞 (HEK293)内表达重组人类白细胞介素-2基因并可以大剂量提纯精制其表达产物（融合蛋 白质）的一种方法，其可进行严格的质量控制且有着非常强的实用性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明提供的人白细胞介素_2蛋白质的制备方法中PCR扩增KSS和IL-2 片段的结果显示图，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-2是KSS的PCR产物，泳道 3为IL-2的PCR产物；
[0025] 图2为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中pTT5-KSS-IL-2连接 鉴定的PCR结果显示图，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-6为pTT5-KSS-IL-2的 PCR产物；
[0026] 图3为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中琼脂糖凝胶电泳检测 菌落实验1#菌液（pTT5-KSS-IL-2#l)测序比对结果；
[0027] 图4为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中蛋白在瞬时转染293F 细胞中表达量检测实验电泳检测图，其中M表示蛋白质分子量大小，C是对照组，泳道左1-6 表示细胞培养液的上清液，泳道右1-6表示通过Nickel浓缩的细胞培养液的上清液，B表 不白蛋白；
[0028] 图5为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中IL-2蛋白质纯化中的 层析图谱；
[0029] 图6为本发明提供的人白细胞介素 -2蛋白质的制备方法中电泳检测纯化的电泳 检测图，其中M表示蛋白质分子量大小，泳道1-14表示从层析柱流出的精制蛋白质；
[0030] 图7为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中SDS-Page电泳检测蛋 白纯度的电泳检测图；以及
[0031] 图8为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中内毒素标准曲线图。
【具体实施方式】
[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
[0033] 下面通过具体的实验来对本发明进行解释。
[0034] 实施例1 :人白细胞介素-2(IL_2)目的基因的克隆
[0035] 1)连接物（KSS)、人白细胞介素-2 (IL-2)片段的扩增
[0036] 所用材料如下：
[0037] 引物（生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）：
[0038] IL-2-1F，序列如 SEQ ID NO :1 所示，IL-2-1R，序列如 SEQ ID NO :2所示，IL-2-2F， 序列如SEQ ID NO :3所示以及IL-2-2R，序列如SEQ ID NO :4所示
[0039] Phusion* 超保真 PCR Master Mix
[0040] dNTP (2. 5mM) (TaKaRa)
[0041] PCR扩增KSS片段的实验步骤是：先按照反应体系，配制PCR反应液：PCR混 合液 100ul、H20 64ul、5X HF buffer 20ul、dNTP(2.5mM)6ul、IL-2-lF(10umol)4ul、 IL_2_1R( IOumo I) 4ul、Phus ion 超保真 DNA 聚合酶 Iul、Temp late :KSS_IL_2 (lOOng/ul) Iul, 然后进行PCR扩增，反应条件为：在体系I中98°C预变性3min后进行98°C变性30s、65°C复 性30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸IOmin后保存于16°C;
[0042] PCR扩增IL-2片段的实验步骤是：先按照反应体系，配制PCR反应液PCR混 合液 IOOul、H2O 64ul、5X HF buffer 20ul、dNTP(2. 5mM)6ul、IL-2-2F(IOumol)4ul、 IL_2_2R( IOumo I) 4ul、Phus ion 超保真 DNA 聚合酶 Iul、Temp late : IL-2 (lOOng/ul) Iul，然后 进行PCR扩增，反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后进行98°C变性30s、65°C复性 30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸IOmin后保存于16°C。
[0043] 通过上述实验操作，成功的完成了 KSS片段和IL-2片段的扩增，结果见图1。
[0044] 2)琼脂糖凝胶回收PCR片段KSS、IL-2
[0045] 采用琼脂糖I*TAE buffer琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收操作，所得琼脂糖凝胶 回收片段浓度：
[0046] KSS 浓度：15. 2ng/ul OD260/OD280:1. 95
[0047] KSS-IL-2 浓度：6. 8ng/ul OD260/OD280:1. 87
[0048] 3)连接和转染 pTT5-KSS-IL_2
[0049] 所用材料如下：
[0050] 琼脂糖凝胶回收载体片段pTT5
[0051] 琼脂糖凝胶回收片段KSS
[0052] 琼脂糖凝胶回收片段IL-2
[0053] SOC培养基
[0054] LB 平板（Amp)
[0055] (.?1ΞΝ?ΞΛΙΠκ Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen)
[0056] 步骤如下：
[0057] 先准备连接反应体系：pTT5 (79. 9ng/ul) I. 50ul、KSS (15. 2ng/ul) 2. 75ul、 IL_2(14.9ng/ul)2.75ul、5X Enzyme Buffer 2.00ul、10X Enzyme Mix I. OOul ;轻轻混勻 上述连接体系，在室温下放置30min，将One Shot? T0P10感受态细胞置于冰上溶化后加入 8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min ;然后在42°C下准确热激 30s，立即转移至冰上放置2min ;再加入250ul室温的SOC培养基，在37°C，200rpm的条件 下孵育Ih ;最后取IOOul细胞均匀涂布于LB平板（100ug/ml Amp)上，在37°C培养箱中培 养过夜，观察平板上细胞生长情况。
[0058] 通过上述实验，平板生长情况次日可见。
[0059] 4)通过PCR检测连接和转染，并挑取菌落制备质粒DNA测序和克隆
[0060] LB 液体培养基（100ug/ml Amp)
[0061] 引物PTT5-F(生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）
[0062] pTT5_R(生工生物工程（上海）股份有限公司，北京合成部）
[0063] 2*Taq MasterMix (北京康为世纪生物技术有限公司）
[0064] 步骤如下：
[0065] 先在每个平板挑取6个单菌落进行菌落PCR，同时接入I. 5ml环氧树脂（EP)管中， 在37°C，200rpm的条件下培养6h ;然后进行菌落PCR，鉴定载体pTT5与DNA片段KSS-IL-2 的连接，其中PCR反应体系为：菌落、2*Taq MasterMix 10ul、引物pTT5-F lul、引物pTT5-R lul、ddH20 8ul，反应条件为：在体系1中94°C预变性IOmin后进行94°C变性30s、55°C复性 30s、72°C延伸lmin，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸IOmin后保存于16°C。
[0066] 如图2所述，通过上述琼脂糖凝胶电泳检测菌落实验，PCR结果1-6显示载体pTT5 与DNA片段KSS-IL-2全部连接到位。pTT5-KSS-IL-2正确序列如SEQ ID Ν0:5所示。选 取上述pTT5-KSS-IL-2#l菌液进行测序，结果如图3所示。
[0067] 5)正确的pTT5-KSS-IL-2进行克隆，提取质粒
[0068] 在150ml LB液体培养基（100ug/ml Amp)中分别接入pTT5-KSS-IL-2克隆的甘油 菌，在37°C，200rpm条件下过夜培养；采用PureYield?Plasmid Mindi System试剂盒进行 提取质粒，所得PTT5-KSS-IL-2浓度为：
[0069] 128. 8ng/ul OD260/OD280:1. 93
[0070] 实施例2 :IL_2蛋白表汰筛洗
[0071] 1)293F细胞瞬时转染条件的优化实验
[0072] 所用材料如下：
[0073] 质粒样品经0· 22um过滤器过滤除菌，用Nanodrop 2000测定浓度；
[0074] Freestyle 293F 细胞，Invitrogen，Cat#R790_07 ;
[0075] Freestyle 293F 细胞表达培养基，Invitrogen，Cat#2338_〇2 ;
[0076] Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966, lmg/ml:将 500mg 的 PEI 粉 末溶于450mL DDH2O中，用HCL将其pH值调至7. 0,加入DDH2O定容体积至500mL，0. 22um过 滤器过滤除菌，分装成每管10mL，-80°C冻存备用；
[0077] 0· 22um 过滤器，Sartorius，17597 ;
[0078] 6 孔细胞培养板，NUNU，Cat#，140675 ;
[0079] 二氧化碳培养箱，SANYO, MC0-20AIC，ID# 为 BINC010 ;
[0080] 托盘摇床，IKA，KS260basic，ID# 为 B0SC015 ;
[0081] pH 计，梅特勒-托利多，FE20，ID# 为 ΒΡΗΜ001 ;
[0082] Nanodrop 2000, Thermo，ID# 为 ΒΝ0Ρ001。
[0083] 步骤如下：
[0084] 先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须 彡90% ;然后将293F细胞密度调整至IX 107ml，接种6孔细胞培养板，4ml/孔；按下表1 的优化方案进行细胞瞬时转染实验，具体操作为分别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺（PEI) 混匀，室温孵育5min，再取相应的体积加入到6孔细胞培养板对应的孔内将转染后的细胞 放置在二氧化碳培养箱中培养，37°C，二氧化碳浓度8%，摇床转速170rpm/min的条件下， 培养7天，收细胞悬液，待检测目的蛋白的表达量。
[0085] 表I IL-2蛋白的表达优化条件
[0086]
【权利要求】
1. 一种人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，通过在人类胚肾细胞293F细胞内 表达重组人类IL-2基因进行制备，其特征在于如下步骤： 1. IL-2基因的克隆 先通过PCR扩增连接物（KSS)和IL-2片段，然后利用琼脂糖凝胶回收PCR产物KSS和 IL-2,将琼脂糖凝胶回收载体片段（pTT5)与琼脂糖凝胶回收产物KSS及IL-2连接并转染 入菌，经培养挑取菌落做PCR，根据PCR结果测序，最后将正确的pTT5-KSS-IL-2进行克隆， 提取质粒； 2. IL-2蛋白表达筛选 先进行人类胚肾细胞293F细胞瞬时转染优化实验，通过测定其蛋白在瞬时转染293F 细胞中的表达量，筛选出高表达的最佳条件，进行IL-2蛋白的表达； 3. IL-2蛋白质的纯化精制 对目标IL-2蛋白质进行分离纯化，并对其进行定量分析； 4. IL-2内毒素检测 将步骤（3)中纯化后的IL-2进行内毒素含量的检测。
2. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，所 述步骤1)中PCR扩增KSS片段和IL-2片段所用的引物为：IL-2_1F，序列如SEQ ID NO :1 所示，IL-2-1R，序列如 SEQ ID N0:2 所示，IL-2-2F，序列如 SEQ ID N0:3 所示，IL-2-2R， 序列如SEQ ID N0:4所示以及表达的质粒设计中引物为：人工序列pTT5-KSS-IL-2,序列如 SEQ ID NO :5 所示。
3. 根据权利要求2所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，所 述步骤1)中所述PCR反应条件为：在体系1中98°C预变性3min后进行98°C变性30s、65°C 复性30s、72°C延伸45s，进入体系2中进行的30个循环的扩增，72°C延伸lOmin后保存于 16。。。
4. 根据权利要求2或3所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征 在于，步骤1)中连接和转化PTT5-KSS-IL-2的步骤包括：将pTT5、KSS、IL-2、5X Enzyme Buffer以及10X Enzyme Mix的连接反应体系混匀，在室温下放置30min，将感受态细胞置 于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min ;然后 在42°C下准确热激30s，立即转移至冰上放置2min ;再加入250ul室温的S0C培养基，在 37°C，200rpm的条件下孵育lh ;最后取100ul细胞均匀涂布于LB平板（100ug/ml Amp)上， 在37 °C培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
5. 根据权利要求4所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，步 骤1)中琼脂糖凝胶电泳检测菌落通过PCR结果进行显示，所用引物为pTT5-F和pTT5-R，所 述的PCR反应条件为：在体系1中94°C预变性lOmin后进行94°C变性30s、55°C复性30s、 72°C延伸lmin，进入体系2中进行30个循环的扩增，72°C延伸lOmin后保存于16°C。
6. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，所 述步骤2)中以最佳IL-2蛋白进行表达的步骤是先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计 算细胞密度和活率，细胞活率必须> 90% ;然后将所述的293F细胞密度调整至IX 106,接 种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为分别取相应量的质粒与 聚乙烯亚胺（PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三角细胞培养；最后将转染 后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37°C，二氧化碳浓度8%，摇床转速170rpm/min 的条件下，培养7天，收细胞悬液，进行蛋白纯化。
7. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，步 骤3)中所述的分离纯化步骤是先将层析系统和层析柱处理好，然后再进行层析纯化，通过 电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在4°C条件下离心40min， 采用0. 22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。
8. 根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于， 步骤4)中所述的内毒素检测步骤是先取lOOul准备好的标准品和样品用加到去内毒素的 管中，加lOOul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37°C恒温孵箱中45min ;然后加 lOOul显色基质到每个管中，混匀，放入37°C恒温孵箱中6min ;再加不同的500ul颜色稳定 剂到每个管中，混匀；最后从每个管中取lOOul液体加到酶标板中，用读板机在545nm的波 长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
【文档编号】C07K14/55GK104372021SQ201410617823
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】王长征 申请人:太仓思源生物医药有限公司
文档序号 :
【 3498751 】
技术研发人员：王长征
技术所有人：太仓思源生物医药有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：王长征
技术所有人：太仓思源生物医药有限公司
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