猪白细胞干扰素的制备方法
【专利摘要】本发明属于生物制剂【技术领域】，尤其涉及一种猪白细胞干扰素的制备方法,通过加入明胶生理盐水分层、离心、重悬沉淀，加入氯化铵溶液离心后培养，加入新城疫病毒NDVⅡ旋转培养，再通过NaOH、Hcl调整PH值，离心去除沉淀后制得猪白细胞干扰素粗制液，将猪白细胞干扰素粗制液先加入灭菌的硫氰酸钾溶解后再进行酸化处理，离心后的沉淀物用雾化法加入乙醇溶液，离心去除沉淀调节PH值后依次加入NaAc、KCNS离心沉淀，将沉淀物加入PBS溶解透析，即制得精制的猪白细胞干扰素，本发明制得的猪白细胞干扰素活性较高，通过氯化铵溶液裂解使白细胞纯度大大提高，NaAc使干扰素提纯效果更好，活性回收率更高，同时提高了干扰素的整体产量，降低了干扰素的生产成本。
【专利说明】猪白细胞干扰素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制剂【技术领域】，特别涉及一种能够有效提高白细胞活力和纯度的猪白细胞干扰素的制备方法。
【背景技术】
[0002]干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，α -(白细胞)型、(成纤维细胞)型和Y-(淋巴细胞)型；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素于1957年由Issacs和Lindeman首先发现,它是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。1979年Carter从猪白细胞中成功诱导出干扰素，研究表明:猪白细胞干扰素(PLeIFN)是一种小分子蛋白质，如同猪的胰岛素、促甲状腺素等小分子多肽，可以作用于动物机体表现出高抗病毒活性而无副作用。PLeIFN作为光谱抗病毒药物，具有抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、调节免疫反应等多种生物学功能，其疗效在医学临床已经得到普遍肯定。随着病原菌新菌株、变异株的不断出现，目前很多药物对某些畜禽疾病已经难以显示满意的防治效果，尤其是病毒性疾病的危害日益严重。特别是近些年来，猪病毒性传染病发病率较高，严重地阻碍着养猪业的发展。而PLeIFN作为一种生物制品，不仅治疗直接，而且安全有效，同时PLeIFN的使用对目前尚无有效药物治疗的猪病毒性疾病具有重要的临床意义。然而，在现有的PleIFN制备过程中，由于白细胞活性低、杂蛋白的过多等原因，导致现有猪白细胞干扰素的生产成本过高、产品质量难控制以及临床疗效不稳定 ，严重影响了猪白细胞干扰素的应用。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于克服现有技术中存在的不足而提供一种能够有效提高白细胞活力和纯度的猪白细胞干扰素的制备方法。
[0004]本发明的目的是这样实现的:一种猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
步骤I)、将无菌方法采集的新鲜抗凝血加入到等体积30g/L的明胶生理盐水中，混合均匀后静置在37°C恒温箱中，至分层清楚，取上层液以3000rpm离心15min，弃上清液，重悬沉淀；
步骤2)、取步骤I收集的沉淀按照体积比1:1加入质量体积浓度0.83%的氯化铵溶液，混合均匀后以3000rpm离心15min，取第一次离心后的沉淀再次按照1:1的比例加入0.83%的氯化铵溶液，混合均匀后以3000rpm离心15min,将二次离心后的沉淀用Hanks液洗漆三遍,加入原全血液I~1.5倍体积量的含5%猪血清的Eagle’s MEM混合培养液悬浮，根据细胞计数的结果进行稀释，将猪白细胞数控制在IX 17个/ml~5X 17个/ml之间；
步骤3)、在已稀释好的每毫升细胞悬液中加入含100个活性单位的猪白细胞干扰素，置于37°C水浴摇床搅拌培养3h ；
步骤4)、按照每毫升猪白细胞悬液40~80HA NDV II的加入量，在细胞悬液中加入一定量新城疫病毒NDV II，于水浴恒温振荡器37°C旋转培养24h，培养时分别在2? 3Κ6? 71ι期间加入I MNaOH溶液将pH控制在7.3~7.4，培养完成后，用6M Hcl把培养液pH调至
3.5，在4°C下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的NaOH溶液把pH调至7.4，离心去除沉淀，上清液即为猪白细胞干扰素粗制液；
步骤5)、取步骤4制得的猪白细胞干扰素粗制液样品作无菌、余毒检查试验，阴性者置低温冰箱储存备用。
[0005]一种猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于:所述的猪白细胞干扰素粗制液通过以下步骤纯化:
①在未经酸化处理的猪白细胞干扰素粗制液中加入灭菌的粉末状的硫氰酸钾，放入超声波清洗仪中加速溶解，使硫氰酸钾最终浓度为0.5M(mol/L)；
溶解后的混合液用6 M Hcl把培养液pH调至3.5，在4°C静置过夜；
S.次日以3500 rpm离心30min，沉淀物中用雾化法加入1/5体积量的_20°C预冷的
95%乙醇溶液，边加边摇，待完全溶解后以2000 rpm离心10min，弃去沉淀；
④上清液以IMNaOH溶液调pH至5.0,以3500 rpm离心30min,收集上清液,用IMNaOH调pH至5.6,然后以2000 rpm离心1min,弃去沉淀；
⑤用IMNaOH将上清液pH调至7.6，离心后的沉淀物加入原猪白细胞干扰素粗制液1/10体积的0.1M NaAc溶液溶解，往上述溶液中加入2M KCNS溶液，使其终浓度为0.5M，将pH调为3.5，置冰箱中过夜，然后以3000 rpm离心15min沉淀；
⑥将步骤⑤制得的沉淀用其5倍体积的0.05M PBS (pH 8.0)进行溶解并在4°C透析3d，每d更换一次透析液，透析脱盐后，经检测CNS_合格，即为精制猪白细胞干扰素，再以15000rpm高速离心Ih后弃去沉淀，上清液即为纯化的猪白细胞干扰素，在_20°C下贮存备用。
[0006]本发明具有如下积极效果:
1、白细胞活性大大提闻
通过对白细胞计数，同时对收集到的白细胞进行台盼蓝染色实验，测定活细胞率。
[0007]实验原理:细胞损伤或死亡时，台盼蓝染料可以穿过变形的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止这类染料进入细胞内，借此可以鉴别死细胞和活细胞。
[0008]结果观察:镜下观察，死细胞被染成浅蓝色，而活细胞拒染。
[0009]细胞活力计算:活细胞率(％)=活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数)X 100% 分别在相同条件下做三组白细胞台盼蓝染色实验，在镜下观察细胞染色情况，并对白细胞数量进行统计，有如下结果:
【权利要求】
1.一种猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)、将无菌方法采集的新鲜抗凝血加入到等体积30g/L的明胶生理盐水中，混合均匀后静置在37°C恒温箱中，至分层清楚，取上层液以3000rpm离心15min，弃上清液，重悬沉淀； 步骤2)、取步骤I收集的沉淀按照体积比1:1加入质量体积浓度0.83%的氯化铵溶液，混合均匀后以3000rpm离心15min，取第一次离心后的沉淀再次按照1:1的比例加入0.83%的氯化铵溶液，混合均匀后以3000rpm离心15min,将二次离心后的沉淀用Hanks液洗漆三遍,加入原全血液I~1.5倍体积量的含5%猪血清的Eagle’s MEM混合培养液悬浮，根据细胞计数的结果进行稀释，将猪白细胞数控制在IX 17个/ml~5X 17个/ml之间； 步骤3)、在已稀释好的每毫升细胞悬液中加入含100个活性单位的猪白细胞干扰素，置于37°C水浴摇床搅拌培养3h ； 步骤4)、按照每毫升猪白细胞悬液40~80HA NDV II的加入量，在细胞悬液中加入一定量新城疫病毒NDV II，于水浴恒温振荡器37°C旋转培养24h，培养时分别在2h~3h,6h~7h期间加入I MNaOH溶液将pH控制在7.3~7.4，培养完成后，用6M Hcl把培养液pH调至3.5，在4°C下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的NaOH溶液把pH调至7.4，离心去除沉淀，上清液即为猪白细胞干扰素粗制液； 步骤5)、取步骤4制得的猪白细胞干扰素粗制液样品作无菌、余毒检查试验，阴性者置低温冰箱储存备用。
2.根据权利要求1所述的猪白细胞干扰素的制备方法，其特征在于:所述的猪白细胞干扰素粗制液通过以下步骤纯化: ①在未经酸化处理的猪白细胞干扰素粗制液中加入灭菌的粉末状的硫氰酸钾，放入超声波清洗仪中加速溶解，使硫氰酸钾最终浓度为0.5M(mol/L)； S溶解后的混合液用6 M Hcl把培养液pH调至3.5，在4°C静置过夜； S次日以3500 rpm离心30min，沉淀物中用雾化法加入1/5体积量的_20°C预冷的95%乙醇溶液，边加边摇，待完全溶解后以2000 rpm离心10min，弃去沉淀； ④上清液以IMNaOH溶液调pH至5.0,以3500 rpm离心30min,收集上清液,用IMNaOH调pH至5.6,然后以2000 rpm离心1min,弃去沉淀； ⑤用IMNaOH将上清液pH调至7.6，离心后的沉淀物加入原猪白细胞干扰素粗制液1/10体积的0.1M NaAc溶液溶解，往上述溶液中加入2M KCNS溶液，使其终浓度为0.5M，将pH调为3.5，置冰箱中过夜，然后以3000 rpm离心15min沉淀； ⑥将步骤⑤制得的沉淀用其5倍体积的0.05M PBS (pH 8.0)进行溶解并在4°C透析3d，每d更换一次透析液，透析脱盐后，经检测CNS_合格，即为精制猪白细胞干扰素，再以15000rpm高速离心Ih后弃去沉淀，上清液即为纯化的猪白细胞干扰素，在_20°C下贮存备用。
【文档编号】C07K1/30GK104072602SQ201410352311
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】李勉, 张永奎, 郭婧, 贾丽敏 申请人:张永奎
文档序号 :
【 3495585 】
技术研发人员：李勉,张永奎,郭婧,贾丽敏
技术所有人：张永奎
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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