具有纤溶亢进的凝血病的治疗的制作方法
具有纤溶亢进的凝血病的治疗本发明涉及具有纤溶亢进的凝血病的领域。更具体地，本发明涉及血友病例如A型血友病或B型血友病的治疗。本发明要求PCT申请PCT/EP2009/004218的优先权，所述申请的公开内容完全并入本文。血友病是损害身体控制血凝或血液凝固的能力的一组遗传性障碍，所述能力用于当血管破裂时阻止出血。A型血友病，最常见的形式，因因子VIII的基因突变引起；B型血友病，也称为克雷司马斯病(Christmasdisease)，因因子IX的基因突变引起。B型血友病，与A型血友病一样，是X染色体连锁的并且占约12%的血友病病例。症状与A型血友病的症状相同受伤后过度出血；以及自发出血，特别地至承重关节、软组织和粘膜内的自发出血。至关节内的反复出血导致关节积血，从而引起通常必需进行关节置换术的令人疼痛的严重关节病。软组织中的血肿可导致包含坏死的凝固的血液的假肿瘤(pseudo tumor);它们可阻塞、挤压或破裂至相邻的器官内并且可导致感染。一旦形成，血肿就难以治疗，即使进行手术也是如此。挤压后神经的恢复不佳，从而导致麻痹。牵涉胃肠道、中枢神经系统或气道/腹膜后空间的那些出血事件，如果未被检测到的话，可导致死亡。颅内出血是血友病患者的主要死亡原因。据估计，在美国有100，000例先天性血友病病例。在这些先天性血友病中，约20，000例为B型血友病病例，此类患者的血液完全缺乏因子IX或严重缺乏血浆因子IX组分。因此，该疾病存在不同的严重程度，需要每周一次至每年一次或两次的治疗。完全缺乏的病例需要每周一次的替代治疗；部分缺乏的病例仅在发生出血事件时才需要治疗，所述出血事件可少至每年一次。先天性部分缺乏的病例中，出血事件通常由临时获得的易感性而非仅由损伤造成。充足的大量新鲜血浆或等量的新鲜血液的静脉内注射暂时校正缺陷受试者的缺陷。有益作用通常持续2或3周，虽然通过体外测试对患者血液测量的凝血缺陷似乎仅改善了 2或3天。这样的利用新鲜血浆或新鲜血液的疗法是有效的，但其具有几个严重缺点(1)其需要随时可获得大量新鲜血浆；(2)需要住院来施用血浆；(3)许多患者对重复的血液或血浆输注变得敏感并且最终遭致致死性输血反应；(4)血浆充其量仅可部分缓解缺乏；以及(5)长期的治疗或手术是不可能的，因为所需要的大量血液或血浆将引起急性和致死性水肿。改进的疗法包括，利用因子VIII或因子IX浓缩物的静脉内替代疗法。然而，同样地该疗法也受到几个不利方面的困扰(1)当治疗重大出血事件时，即使进行了迅速的检测和治疗，组织损伤也仍然存在；(2)许多患者变得抗拒凝血因子并且产生针对凝血因子的抑制性抗体(所谓的具有抑制剂的血友病)；(3)尽管使用了改进的病毒灭活法，但仍然存在增加的被致死性病毒例如HIV和丙型肝炎病毒污染的风险(据估计，在美国超过50%的血友病群体，超过10，000人通过受感染的血液供给感染了 HIV) ；(4)分离的凝血因子，尤其是重组凝血因子非常昂贵，并且在发展中国家通常是不可获得的。在替代疗法之外来治疗或预防出血是个挑战，因为血友病的出血是个复杂的病理生理过程，该过程可归因于三个缺陷(1)在低组织因子浓度上通过外部途径的减少的凝血酶产生，(2)通过内部途径的减少的凝血酶产生的继发性爆发，和(3)通过内部途径的纤维蛋白溶解系统的存在缺陷的下调。减少的凝血酶产生导致减少的凝血倾向，从而导致增加的出血风险的事实已被广泛接受。然而，过去十年的工作显示，纤维蛋白溶解的下调缺陷可能也在血友病中起着重要作用。因此，血友病还可被分类为具有纤溶亢进的凝血病。最近的出版物通过体外显示如下现象来支持该假设当血块在因子VIII耗尽并且补充有组织型纤溶酶原激活物tPA的血浆(FVII1-DP)中形成时，纤维蛋白溶解不能被充分下调，结果血块过早溶解(Broze和Higuchi, Bloodl996, 88:3815-3823 ；Mosnier ；Thromb. Haemost. 2001, 86:1035-1039)。此外，已显不，该“过早溶解”归因于凝血酶-可激活的纤维蛋白溶解抑制剂(TAFI)的减少的激活或不存在所述激活(Βι ζθ和Higuchi, 1996)，并且在FVII1-DP中，包含激活的TAFI的混合物增加了血块溶解时间。已得出结论稳定化的TAFI可用于治疗血友病(W002/099098)。TAFI在纤维蛋白溶解的下调中起着关键作用，其是形成稳定的血块所必需的。TAFI (也称为血浆羧肽酶原B2或羧肽酶原U)是当暴露于凝血酶-血栓调节蛋白复合物时，通过在Arg92上的蛋白质水解被转化成抑制纤维蛋白溶解的基础羧肽酶(bas iccarboxypeptidase) (TAFI·a或激活的TAFI)的血衆酶原。其通过从血纤蛋白除去C末端赖氨酸和精氨酸残基(其对于纤溶酶原的结合和激活是非常重要的)而有效地减弱纤维蛋白溶解。如上所论述的，与凝血酶复合的血栓调节蛋白(TM)负责TAFI激活。血栓调节蛋白为用作内衬血管的内皮细胞上的凝血酶受体的膜蛋白。凝血酶为凝血级联中的中心酶，其将血纤蛋白原转化成形成基质凝块的血纤蛋白。首先，局部损伤导致从其无活性前体凝血酶原产生少量凝血酶。接着，凝血酶激活血小板和，接下来，某些凝血因子包括因子V和VIII。后一作用产生所谓的凝血酶爆发(另外的凝血酶原分子的大量激活)，这最终导致形成稳定的血块。然而，当结合于血栓调节蛋白时，凝血酶的活性被间接改变凝血酶-血栓调节蛋白复合物的主要特征是其激活蛋白C的能力，所述蛋白C随后通过蛋白质水解性灭活重要的辅因子，因子Va和因子VIIIa来下调凝血级联(Esmon等人，Ann. N. Y. Acad. Sc1.(1991)，614:30-43)，从而提供抗凝血活性。凝血酶-血栓调节蛋白复合物也能够激活凝血酶-可激活的纤维蛋白溶解抑制剂(TAFI)，其随后拮抗纤维蛋白溶解(参见上文)。成熟人TM包含559个残基的单个多肽链，且由5个具有下列定位的结构域组成氨基末端“凝集素样”结构域、包括6个表皮生长因子(EGF)样重复的"6EGF-样重复结构域〃、O-糖基化结构域、跨膜结构域和胞质结构域(氨基酸位置如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中所示):
权利要求
1.一种血栓调节蛋白类似物，其在与凝血酶结合后，与TMEM338L相比，具有减小的辅因子活性，所述类似物具有 a)根据SEQID N02的氨基酸序列，或 b)根据SEQID N03的氨基酸序列，或 c)根据SEQID N04的氨基酸序列，或 d)与根据SEQID N02, SEQ ID:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%，更优选至少95%，最优选至少98%的同一性的氨基酸序列，或 e)血栓调节蛋白片段，其基本上由下述组成SEQID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ IDN0:4的6个EGF样重复结构域(如SEQ ID NO:1中编号的氨基酸位置227至462)、SEQ IDNO: 2，SEQ ID NO: 3或SEQID NO: 4的EGF-样重复结构域3至EGF-样重复结构域6 (如SEQID NO:1 中编号的氨基酸位置 307 至 462)或 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQID NO:4 的EGF-样重复结构域3的c环至EGF-样重复结构域6 (如SEQID NO:1中编号的氨基酸位置333 至 462)， 其中位置376 (如根据SEQ ID NO 1中编号的)上的苯丙氨酸被缺失或被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸置换。
2.权利要求1的血栓调节蛋白，其还在位置387(如SEQ ID NO:1中编号的)上包括谷氨酰胺残基的缺失或置换，其中所述置换优选被Met、Thr、Ala、Glu、His、Arg、Ser, Val、Lys， Gly、lie、Tr、Tyr，Leu、Asn、Phe、Asp、Cys 置换。
3.权利要求1或2的血栓调节蛋白，其还在位置388(如SEQ IDNO中编号的)上包含甲硫氨酸残基的缺失或置换，其中甲硫氨酸残基优选被Gin、Tyr，lie、Phe、His、Arg、Pro、Val、Thr、Ser，Ala、Trp、Asn、Lys，Gly、Glu、Asp、Cys 置换。
4.上述权利要求的任一项的血栓调节蛋白，其还在位置389(如SEQ ID N0:1中编号的)上包括苯丙氨酸残基的缺失或置换，其中苯丙氨酸优选被Val、Glu、Thr、Ala、His、Trp、Asp、Gin、Leu、lie、Asn、Ser， Arg、Lys， Met，Tyr，Gly、Cys， Pro 置换。
5.权利要求的任一项的血栓调节蛋白，其中所述血栓调节蛋白包含如表4中描述的一个或多个第一和第二氨基酸修饰。
6.权利要求的任一项的血栓调节蛋白，其中所述血栓调节蛋白包含如表5中描述的一个或多个第一、第二和第三氨基酸修饰。
7.血栓调节蛋白类似物用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗具有纤溶亢进的凝血病，其中 a)TM类似物如上述权利要求的任一项所定义，或 b)所述TM类似物的特征在于，在治疗有效剂量上显示抗纤维蛋白溶解作用。
8.权利要求7的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物显示一个或多个下列特征 (i)与兔肺血栓调节蛋白相比，减小的对凝血酶的结合亲和力，和/或kD值超过O.2nM的对凝血酶的结合亲和力；和/或 (ii)与TM类似物TMEM388L的辅因子活性相比，减小的辅因子活性， (iii)与TM类似物TMeM388L相比，增加的TAFI激活活性对辅因子活性的比率。
9.权利要求7或8的用途，其中所述具有纤溶亢进的凝血病选自如下疾病A型血友病、B型血友病、C型血友病、血管性血友病(vWD)、获得性血管性血友病、因子X缺乏、副血友病、凝血因子1、I1、V或VII的遗传性障碍、因循环抗凝物引起的出血障碍或获得性凝血缺乏。
10.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物用于治疗一个或多个选自下列的出血事件颅内出血或其它CNS出血、关节、微毛细血管、肌肉、胃肠道、呼吸道、腹膜后空隙或软组织中的出血。
11.上述权利要求的任一项的用途，其中所述患者具有抗-因子VIII抗体。
12.上述权利要求的任一项的用途，其中所述患者用因子VIII，优选重组因子VIII或重组的缺失B结构域的因子VIII分子，更优选辛凝血素a或莫罗凝血素a来进行治疗。
13.上述权利要求的任一项的血栓调节蛋白类似物用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的用途，其特征在于将所述血栓调节蛋白类似物与因子VIII，优选重组因子VII1、重组的缺失B结构域的因子VIII分子，更优选辛凝血素a或莫罗凝血素a组合施用。
14.上述权利要求的任一项的用途，其中所述患者用因子VII1、优选重组因子VII1、更优选辛凝血素a来进行治疗。
15.上述权利要求的任一项的用途，其中在出血发作时施用所述血栓调节蛋白类似物。
16.上述权利要求的任一项的用途，其中在增加的出血风险例如手术或拔牙之前施用所述血栓调节蛋白类似物。
17.上述权利要求的任一项的用途，其中给难以用血液/血浆输注或凝血因子替代疗法治疗的患者施用所述血栓调节蛋白类似物。
18.上述权利要求的任一项的用途，其中优选在短于I周至4周的总时间中，每天一次，每2天一次，或每3、4、5、6或7天一次，更优选以长期施用的方式，以多个剂量施用所述血栓调节蛋白类似物。
19.上述权利要求的任一项的用途，其中以胃肠外施用的方式，优选以静脉内或皮下施用的方式，施用所述血栓调节蛋白类似物。
20.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物为可溶性TM类似物。
21.权利要求20的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物为人可溶性TM类似物。
22.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物包括选自EGF3、EGF4、EGF5、EGF6的至少一个结构域，优选包含片段EGF3-EGF6，更优选包含EGF结构域1_6。
23.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物由EGF结构域EGFl至EGF6组成，更优选由EGF结构域EGF3至EGF6组成。
24.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物具有相应于成熟血栓调节蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中描述的)的氨基酸序列，并且包括下列修饰中的一个或多个 a)氨基酸1-3的去除；b)M388L；c)R456G；d)H457Q； e)S474A，和在P490上的终止。
25.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物具有包含与SEQIDNO: 2具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性的序列的氨基酸序列。
26.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物在相应于天然序列(根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3)的一个或多个如下位置上具有氨基酸修饰aa) 349Asp;bb) 355Asn; ac)357Glu; ad)358Tyr; ae)359Gln; af)361Gln; ag)363Leu; ah)364Asn;ai)368Iyr;aj) 371Val;ak) 374Glu;al) 376Phe; am) 384His;an) 385Arg; ba)387Gln; bb)389Phe; be) 398Asp; bd)400Asp; be)402Asn; bf)403Thr; bg)408Glu; bh)411Glu; bi)413Tyr; bj) 414Ile; bk) 415Leu; bl) 416Asp; bm) 417Asp; bn) 420Ile; bo) 423Asp; bp) 424Ile; bq) 425Asp; br) 426Glu; ca)428Glu; cb)429Asp; cc)432Phe; cd)434Ser;ce)436Val; cf)438His; eg) 439Asp; ch)440Leu; 443nTLci)Ihr;c j) 444Phe;ck) 445Glu;cl) 456Arg;cm) 458Ile ;或cn) 461Asp0
27.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物在根据SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的位置376上具有苯丙氨酸的修饰，其优选被脂族氨基酸置换，更优选被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸置换，最优选被丙氨酸置换。
28.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物具有根据SEQIDNO:1或SEQ ID N0:3的下列氨基酸中的一个或多个氨基酸的修饰 a)387Gln; b)388Met; b)389Phe, 其中所述氨基酸被缺失，被一个或多个额外的氨基酸插入，或优选被置换。
29.上述权利要求的任一项的用途，其中所述血栓调节蛋白类似物以其氧化形式使用，优选被氯胺T、过氧化氢或高碘酸钠氧化。
30.权利要求19的用途，其中TM类似物内的一个或多个甲硫氨酸残基被氧化，优选位置388 (根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3)上的甲硫氨酸残基被氧化。
31.筛选适用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的血栓调节蛋白类似物的方法，其中所述血栓调节蛋白显示下列特征中的一个或多个 (i)减小的对凝血酶的结合亲和力， ( )减少的辅因子活性， (iii)增强的TAFI激活活性， 所述方法包括步骤 a)产生血栓调节蛋白序列(SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3)的一个或多个氨基酸置换，优选在权利要求15中所列的氨基酸位置上的一个或多个氨基酸置换； b)针对下列特征中的一个或多个，将修饰的类似物与对照分子，优选兔肺TM或可溶性人TM类似物相比较 ba)对凝血酶的结合亲和力(KD值)； bb)辅因子活性; be) TAFI激活活性或TAFIa潜能； bd)TAFI激活活性与辅因子活性的比率； be)蛋白质氧化的作用； bf)在体外测定中在时间上对血块溶解的影响；或bg)在凝血相关动物模型中的作用。
32.治疗具有纤溶亢进的凝血病的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求1至20的任一项的血栓调节蛋白类似物。
33.治疗具有纤溶亢进的凝血病的方法，其包括施用O.75 μ g/kg至140 μ g/kg待治疗的受者的体重的剂量的根据权利要求1至20的任一项的血栓调节蛋白类似物。
34.一种药物组合物，其以O. 75 μ g/kg至140 μ g/kg待治疗的受试者的体重的剂量包含用于治疗具有纤溶亢进的凝血病的根据权利要求1至20的任一项的血栓调节蛋白类似物。
全文摘要
本发明涉及血栓调节蛋白类似物用于制备用于治疗具有纤溶亢进的凝血病例如血友病障碍的药剂的用途。此类血栓调节蛋白类似物在治疗有效剂量上显示抗纤维蛋白溶解作用。公开了新的蛋白质修饰和用于鉴定其的方法。
文档编号C07K14/745GK103037893SQ201080068202
公开日2013年4月10日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年6月14日
发明者K-U·彼得森, M·E·内舍姆, J·H·福莱 申请人:帕昂德国有限公司
文档序号 :
【 3505784 】
技术研发人员：K-U·彼得森,M·E·内舍姆,J·H·福莱
技术所有人：帕昂德国有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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