一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法
专利名称：：一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种优化分泌表达重组人角质细胞生长因子(rhKGF-2)的制备方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。
背景技术：
：角质细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor，KGF)是在1989年由Rubin等从人胎肺成纤维细胞的培养上清中分离并纯化的，并发现具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用，故将其定名为角质细胞生长因子。1996年Yamasaki等从鼠的胚胎中扩增出一种新的生长因子，即与KGF密切相关的另一种新的细胞因子，称为KGF-2，又叫作成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)。之后Emoto等从人肺中克隆到人KGF-2的cDNA，该基因定位于人第5号染色体5pl2-5pl3，人FGF-10由624个核甘酸组成，编码208个氨基酸，分子量为19.3KD，与KGF-1有57%的同源性。KGF-2主要由间充质细胞合成，通过与上皮细胞细胞膜上的受体作用，特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。KGF-2与KGF-1的生物学功能到目前研究为止有许多相同之处，如都能增加表面外胚层来源的上皮细胞增生，对其它细胞则无作用；由间充质细胞产生，以旁分泌的方式作用于上皮细胞等。但KGF-2在促进创伤愈合、减少瘢痕形成等方面优于KGF-l，这些特点使KGF-2更适合于开发新的治疗创伤的基肉工程药物。KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用。KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受R0S诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。此外，KGF-2同时也能通过刺激其他在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子、转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑。KGF-2对皮肤的切口损伤修复过程有明显的改善，可用于加速外科手术后的伤口愈合。此外，KGF-2对移植皮肤的愈合也具有极显著的促进作用。这可能是因为它能够增加伤口处的机械张力和伤口胶原蛋白含量，促进表皮细胞的生长，加快上皮和肉芽组织的形成，加速创口愈合。因此KGF-2可能是细胞内起动和加速伤口愈合的一个十分重要的媒介物。同时有研究表明，在这一过程中KGF-2能够增加TGF-a和PDGF-AB的分泌，而这一效应说明KGF-2可能正是作用于角质细胞、纤维原细胞和内皮细胞，以及促进表皮再生的媒介分子。KGF-2对于异体骨髓移植后引起的移植物抗宿主病也有一定的抑制作用。异体骨髓移植是恶性血液疾病的首选治疗方法，这个方法的效果与移植物抗白血病反应有很大的关系，而GVHD则是使骨髓移植受限的主要因素，是异体骨髓移植术后的主要并发症，急性GVHD主要引起皮肤、肝脏和肠道等多器官上皮细胞坏死。Clouthier等用鼠科动物BMT模型B63B6D2F1来研究KGF-2对于GVHD的影响。受试小鼠在给予KGF-2(每天5mg/kg)后，全身性的GVHD和靶器官的组织病理方面均有明显的降低。与对照组相比，KGF-2同时还导致小鼠的血清中肿瘤坏死因子-a水平和脂多糖水平的下降。相反，KGF-2并不影响T细胞的增殖、细胞因子的产生或对抗宿主抗原的细胞毒反应。动物模型的研究表明，在预防辐射对正常机体造成的损伤方面，KGF-2有非常显著的作用。它能提高骨髓对全身辐射的耐受性，保护小肠隐窝免受辐射损伤，降低辐射引起的胃肠道损伤，预防粘膜炎的发生，并能调节和维持干细胞的分裂及存活。此外，KGF-2对渍疡和肠炎也有很好的疗效，静脉注射KGF-2几乎能完全恢复小鼠肠道表面的正常细胞构造，显著降低急性和慢性肠损伤。持续的KGF-2给药，能维持小鼠正常体重，改善宏观和微观肠炎症和溃疡，并且没有明显的毒副作用。目前，美国人类基因组科学公司正在进行三项KGF-2的II期临床实验一是静脉溃疡；二是骨髓移植前高剂量化疗引起的粘膜炎；三是溃疡性大肠炎。其中静脉溃疡的实验已基本完成，实验结果显示了KGF-2良好的疗效和安全性。KGF-2作为一种新型多肽类药物有着广阔的开发和应用前景。目前国际上的rhKGF-2大肠杆菌表达系统生产工艺，其表达产物无论是否以可溶性蛋白形式存在，都表达于胞浆内，且必须经过超声波破碎菌体后才能使蛋白释放出来，不但对蛋白本身有破坏作用，而且也增加了纯化的难度与成本。因此，本领域迫切需要开发一种新型简易的制备方法，在不用通过超声波完全破碎菌体的情况下就能够获得人角质细胞生长因子-2，从而减少粗提时对蛋白的破坏，简化纯化步骤，提高成品的产量。
发明内容本发明的目的是提供一种简便并且高效的制备rhKGF-2的方法。本发明的另一目的是提供一种用于该方法的表达载体和宿主细胞。在本发明的第一方面，提供了一种优化的表达人角质细胞生长因子-2的表达载体，它含有分泌信号肽编码序列，能将KGF-2蛋白分泌到细胞周质中表达，即为pET22b(+)。在本发明的第二方面我们将KGF-2正确编码序列应用^Vco/禾n历V^/7/酶切后插入到分泌信号肽pe/5的后面，这样设计的好处在于我们可以得到与天然KGF-2氨基酸序列相同的蛋白质序列而不用担心有其他杂质氨基酸掺入。在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的表达载体编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列。所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。该菌体的细胞壁较脆弱，在反复冻融的条件下就可破裂，释放出周质间隙中的蛋白。在本发明的第四方面，提供了一种生产人角质细胞生长因子-2的方法，它包括步骤(a)通过LB培养基和改良种子培养基进行工程菌的活化和扩增，在适当的罐内培养基及补料方式，培养参数控制条件下表达外源蛋白角质细胞生长因子-2;(b)通过低温高速离心或超滤方式获得含外源蛋白角质细胞生长因子-2的菌体。在另一优选例中，所述的表达载体是含IPTG诱导的启动子的表达载体pET22b(+)-rhKGF-2，或者所述的宿主细胞是大肠杆菌。在另一优选例中，在步骤(a)中进行高密度发酵。在另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤(i)采用冻融破碎发酵菌体，低温高速离心弃沉淀收上清；(ii)通过盐析和或超滤对破菌液上清液进行初步纯化；(iii)柱层析采用阳离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析及其组合。在另一优选例中，所述的培养条件是培养温度为3237'C，更佳地3537°C;pH在68之间，更佳地在6.87.3之间；葡萄糖或甘油浓度为110%，更佳地在36%;诱导剂IPTGO.1lmM，更佳地在0.50.8raM;诱导前0D,在0.820之间，更佳地在1518之间；诱导时间28小时，更佳地46小时。图1:表达载体pET22b(+)-rhKGF-2的构建线路图。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，用优选的载体pET22b(+)进行表达，该载体有助于rhKGF-2真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式分泌到细胞周质间隙中，只通过反复冻融菌体就可释放出目的蛋白，从而简化了分离纯化工艺。在另一优选例中，用本发明优化的hKGF-2编码序列转化的大肠杆菌BL21(DE3)，经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhKGF-2以可溶、活性形式存在于细胞周质，同时简便纯化工艺，通过反复冻融的方法即可以破碎菌体，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种制备rhKGF-2的方法。本发明的载体包括表达质粒，例如含IPTG诱导的启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中插入了人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)的编码序列。一种特别优选的表达载体是载体pET20b(+)、pET22b(+)、pET26b(+)和pET27b(+)。适用于本发明的宿主菌是原核宿主细胞，尤其是大肠杆菌BL21(DE3)。通常，在KGF-2优选序列的5'端与3'端分别加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点，然后克隆入含IPTG诱导的启动子的表达质粒中，转化与表达载体相容的大肠杆菌宿主菌，经筛选鉴定后获得工程菌。本发明的工程菌属于IPTG诱导型。在本发明中，工程菌表达rhKGF-2的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。通常，工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NHX1等为氮源，甘油、葡萄糖、糖蜜等为碳源，磷酸盐等为无机盐，添加维生素及微量元素作为基础培养基；并通过控制参数(pH、温度、罐压、搅拌速度等)的调节及流加方式(酸碱及营养元素)，调节溶氧(D0)，比生长速率等因素，减少乙酸的积累，提高了菌体产量及表达水平。对于培养基的选择，通常包括氮源、碳源、无机盐、维生素、微量元素等的选择。(a)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源为蛋白胨、酵母粉的混合物，总浓度1.5-4%;无机氮源如氨水或NHX1等铵盐，浓度0.41%。(b)无机盐包括磷酸盐、镁盐、钙盐等。较佳的磷酸盐缓冲体系浓度2050mM，pH6.57.5;镁盐、l丐盐浓度为0.11慮。(c)在培养基中添加维生素B作为生长因素，浓度150ug/L。(d)微量元素包括Fe3+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、硼酸等，浓度为10—810—6mM。(e)碳源包括甘油、葡萄糖、糖蜜等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳的甘油浓度为36%;葡萄糖浓度为35%。(f)诱导剂使用IPTG，较佳的浓度在0.50.8mM;(g)培养阶段溶氧(D0)30X以上，诱导阶段在50%以上；pH培养阶段控制在6.87.0，诱导阶段控制在7.27.4;温度培养阶段控制在3537°C，诱导阶段控制在3032°C;在发酵表达rhKGF-2后，以离心方式去除发酵液上清，获得菌体。应用反复冻融的方式进行破菌，用缓冲溶液悬浮菌体后，对粗提液进行离心，去沉淀，收获上清液。粗提液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析。(a)离子层析。选择CMS印haroseFastF凝胶介质，盐梯度洗脱。(b)亲和层析选择肝素亲和H印arinS印haroseCL-6B凝胶介质，盐梯度洗脱。经过二步纯化，可得到纯度95X以上的rhKGF-2蛋白。纯化后rhKGF-2可用常规技术制成各种剂型。在本发明的一个实例中，选择了有助于真核基因在原核细胞中正确翻译的分泌型质粒载体含IPTG诱导的启动子的表达载体，且在所述表达载体中插入了rhKGF-2的编码序列，构建高效、稳定分泌表达的rhKGF-2工程菌(大肠杆菌)。经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhKGF-2以可溶形式存在于细胞周质；表达水平高，占菌体总蛋白20%左右。由于表达水平较高，rhKGF-2又可以分泌到细胞周质中，且具有天然活性，不但避免了粗提过程对蛋白质的破坏，而且提高了纯化收率，降低了成本。通过简便、快速的纯化方法，即获得高质量的rhKGF-2纯品。本发明的优点在于(1)表达工艺简单。(2)表达量高。通过补料方式，使表达水平达到20%以上，菌体产量达60g/L以上。(3)纯化工艺简便，回收率高。由于蛋白可以分泌到细胞周质中表达，因此简化了纯化工序，提高了成品率，使大规模生产rhKGF-2成为可能。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法。实施例1rhKGF-2表达工程菌的构建1.目的基因的合成根据已知的rhKGF-2的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变氨基酸序列的条件下，设计rhKGF-2的编码序列引物。通过搭桥PCR方法获得rhKGF-2的全长序列。人工合成重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)基因的全序列时，在该基因的5，端引入.NcoI酶切位点及在3，端引入HindIII酶切位点。2.表达质粒-pET22b(+)-rhKGF-2的构建与转化宿主菌表达质粒为购自InVitrogen公司的pET22b(+)表达载体(该表达载体含有IPTG诱导的启动子和peIB分泌信号态)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。用Ncol和HindIII双酶切分别处理基因rhKGF-2和表达载体pET22b(+)，37'C酶切2小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16"C连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(100ug/mU的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定抽提的质粒DNA用限制性内切酶及Ncol+Hindlll在37'C反应3小时，得到在pET22b(+)中插入了rhKGF-2基因的重组质粒pET22b(+)-rhKGF-2。利用菌落PCR进行阳性鉴定。应用NcoI+HindlII双酶切时，能切出大小约500bp的片段，表明序列已正确插入载体pET22b(+)中。酶切鉴定结果显示经过NcoI+HindlII双酶切后，能从电泳上看到大小约500bp左右的片段，以上情况说明KGF-2基因己正确插入载体pET22b(+)中。此外，用常规方法进行正、逆向序列分析，委托大连宝生物公司进行序列的测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。摇瓶试验，该工程菌培养后，经IPTG诱导2小时后，目的蛋白表达量占总蛋白20%左右。实施例2合适表达载体的选择按照实施例1类似的方法，将KGF-2序列分别插入几个不同的表达载体，如pET28a(+)(购自invitorgen公司)、pET29a(+)(购自invitrogen公司)、pET-30Ek/LIC购自invitorgen公司)的相同酶切位点(NcoI/Hindin)，获得质粒pET28a(+)—rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF—2，pET—30Ek/LIC-rhKGF-2。将质粒pET28a(+)-rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF-2，pET-30Ek/LIC-rhKGF-2分别转化相应的宿主菌，挑选出抗性菌株。与含质粒pET22b(+)/rhKGF-2的工程菌一起进行摇瓶试验，经IPTG(或阿拉伯糖)诱导2小时后，含质粒pET22b(+)-rhKGF-2的工程菌表达的目的蛋白表达量占总蛋白20%左右，而含质粒pET28a(+)-rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF-2，pET-30Ek/LIC-rhKGF-2的工程菌表达的目的蛋白表达量分别占总蛋白10%,12%和15%。这表明，pET22b(+)-rhKGF-2表达载体优于其他表达载体。实施例3选择最佳培养基挑实施例1中制备的转入pET22b(+)-rhKGF-2的大肠杆菌BL21(DE3)单克隆，接种到含50mlLB种子液的250ml三角烧瓶中，培养34hr，待OD,达到0,81.0，按1:10的比例接种于含250ml改良种子液的誦ml三角烧瓶中，培养810h左右，待0D,达到68，按1:10上罐发酵，流加碳源(甘油)、镁盐、氨水调节pH6.87.0、温度37°C、D0〉30%，待OD,达到1518，加入0.50.8raMIPTG开始诱导，适当补加碳源(甘油)、氮源、磷酸盐缓冲液调节pH7.27.4、D0>50%、温度3032。C、诱导45hr结束。样品进行SDS-PAGE检测(并扫描)、测定蛋白含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例4工程菌高密度发酵的研究接种到含50mlLB种子液的250ml三角烧瓶中，培养34hr，待OD,达到0.81.0，按1:10的比例接种于含250ml改良种子液的1000ml三角烧瓶中，培养810h左右，待0De。。达到68，按1:10上罐发酵，流加碳源(甘油)、镁盐、氨水调节pH6.87.0、温度37°C、D0〉30%，待OD,达到1518，加入0.50.8raMIPTG开始诱导，适当补加碳源(甘油)、氮源、磷酸盐缓冲液调节pH7.27.4、D0〉50%、温度3032°C、诱导5hr结束。样品进行SDS-PAGE检测(并扫描)、测定蛋白含量。实施例5rhKGF-2的纯化发酵液在4。C下5000rpm离心10min，得菌体，菌体-8(TC速冻24h后室温缓慢融化，再-2(TC冷冻7天后室温缓慢融化。显微镜观察，菌体细胞壁破裂，成为原生质球。20000rpm离心30min，得上清。超滤浓縮及更换缓冲液使用狙llipore超滤器，超滤膜截流分子量为IOKD，超滤时留取浓縮液(作用是去除小分子杂质和盐类)。1.层析2(阳离子层析)层析介质CMS印haroseFastF缓冲液溶液A:PBS(PH7.4，20raM)溶液B:PBS(PH7.4，20mM)+1MNaCl上样将超滤浓縮的rhKGF—2溶液上样。清洗上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。梯度清洗后用10CV将溶液B从0%升至100%。收集收集rhKGF-2样品峰。2.层析2(亲和层析)层析介质-HeparinSepharose(X-6B缓冲液溶液A:PBS(PH7.4，20mM)溶液B:PBS(pH7.4，20mM)+lMNaCl上样将离子交柱层析蛋白溶液上样。清洗上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。梯度清洗后用10CV将溶液B从0X升至100X。收集收集rhKGF—2样品峰。样品经过此二步纯化，即离子层析、亲和层析以后，纯度提高至95%以上。权利要求1.一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法，其特征在于，提供了一种优化的表达人角质细胞生长因子-2的表达载体，它含有分泌信号肽编码序列，能将KGF-2蛋白分泌到细胞周质中表达，即为pET22b(+)。2.权力要求1所述的制备方法，提供了一种大肠杆菌细胞，它含有本发明所述的表达载体和编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列。该宿主细胞壁较脆弱，在反复冻融的条件下就可破裂，释放出周质间隙中的蛋白，即为BL21(DE3)。3.权力要求1所述的制备方法，提供了一种裂解重组蛋白的制备方法，即将宿主细胞低温反复冻融，在不破坏细菌内膜的情况下即可使重组蛋白释放到缓冲液中。全文摘要本发明提供了一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法，该方法提供了一种重组人角质细胞生长因子-2的表达载体，它含有分泌信号肽编码序列，能将KGF-2蛋白分泌到细胞周质中进行表达，含有此重组质粒的宿主细胞经低温反复冻融，在不破坏细菌内膜的情况下即可使重组蛋白释放到缓冲液中，不破坏蛋白的活性。文档编号C12N15/12GK101538571SQ20081003015公开日2009年9月23日申请日期2009年2月17日优先权日2009年2月17日发明者刘孝菊,娜姚,张云龙,李校堃,萍杨,王会岩,王晓杰,王艳芳,田海山,健肖,肖业臣,黄亚东,黄志锋申请人:温州医学院;广东暨大基因药物工程研究中心有限公司;吉林农大生物反应器工程有限公司
文档序号 :
【 4121739 】
技术研发人员：李校堃,王晓杰,张云龙,田海山,王会岩,黄志锋,黄亚东,王艳芳,姚 娜,杨 萍,肖业臣,刘孝菊,肖 健
技术所有人：李校堃,王晓杰,张云龙,田海山,王会岩,黄志锋,黄亚东,王艳芳,姚娜,杨萍,肖业臣,刘孝菊,肖健
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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