一种重组人转化生长因子tgfb3的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组人转化生长因子TGFB3的制备方法，其特征在于，包含包涵体的收集和洗涤；包涵体的溶解；变性蛋白的纯化；单体蛋白的复性；复性蛋白的纯化五个步骤，该五步法解决的现有技术中纯化复性TGFB3收率低的缺陷，提高了蛋白的活性，同时有效的降低了成本，有利于工业化大生产。
【专利说明】—种重组人转化生长因子TGFB3的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种重组人转化生长因子TGFB3的制备方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]皮肤组织损伤后的创面组织修复是医学中最古老的课题之一，这个复杂的正常病理生理过程至今其机制仍不完全清楚，主要过程包括:炎症反应、肉芽组织形成、伤口收缩及再塑。疤痕指皮肤从真皮乳头层到深部发生损伤后，缺失部位以结缔组织置换。结合临床和病理学特征，疤痕通常可以分为三类:1.瘢痕疙瘩，其形态如蟹爪状，具有向四周浸润性生长的特点；2.增生性瘢痕，又称肥厚性疤痕，隆起高出于皮面；3.扁平疤痕，平坦，不高于皮面。一般文献中常把前两种称之为异常症痕，而第三种为正常瘢痕。
[0003]由于创伤、运动伤、手术切口等多种原因，导致皮肤外伤机会多，疤痕的发生率也很高。异常瘢痕局部隆起、发红、瘙痒，并常有继发挛缩畸形，造成容貌的毁损和身体机能障碍，给患者带来不便与痛苦。据《柳叶刀》杂志统计，每年全球有2亿3千万手术量，可见疤痕的潜在威胁十分巨大。在临床上，强调创面早期各种前瞻性防范措施的应用，以及疤痕形成前后的综合性治疗，但目前临床可选用药物极其匮乏，对异常疤痕的治疗缺乏有效的手段和方法。
[0004]增生性疤痕是创伤及外科手术后常见的皮肤等组织的后遗症，一般认为，在创面愈合过程中，细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的过渡产生或(和)沉积是症痕形成的主要成因，同时ECM的过渡沉积也是疤痕的重要病理学特征和疤痕增生发展的主要物质基础。目前研究证明，多种细胞因子参与了创面愈合过程中ECM的产生和沉积，而转化生长因子(Transforming Growth Factor Beta, TGF-Beta)就是创面愈合过程中与症痕形成最为密切，也是最具有代表意义的细胞因子。
[0005]转化生长因子B (transforming growth factorl3, TGFB)是一组结构相关、功能相似的多功能活性多肽。到目前为止，研究人员在脊椎动物中已发现5种TGF-B蛋白，即TGFBetal~Beta5，而哺乳动物中仅发现3种:TGF Betal_Beta3。
[0006]现有研究结果证实，TGF_Beta3在胚胎无瘢愈合中起非常重要的作用。在创面愈合过程中，TGF-Betal、TGF-Beta2有促进ECM沉积导致疤痕形成的作用，而TGF_Beta3则具有促进创面愈合和减少疤痕形成的双重生物学作用。国外学者已开始通过动物创伤模型探讨应用外源性TGF_Beta3来减少创面肉芽组织过渡生长及再塑阶段的疤痕形成，并得到令人鼓舞的结果。
[0007] TGF-Beta s是一种具有多重生物学作用的多肽蛋白分子，在哺乳类中主要有TGF-BetaU TGF_Beta2、TGF_Beta3三种异构体。现有研究结果证实，TGF_Beta3在胚胎无瘢愈合中起非常重要的作用。在创面愈合过程中，TGF-Betal、TGF-Beta2有促进ECM沉积导致疤痕形成的作用，而TGF_Beta3则具有促进创面愈合和减少疤痕形成的双重生物学作用。国外学者已开始通过动物创伤模型探讨应用外源性TGF_Beta3来减少创面肉芽组织过渡生长及再塑阶段的疤痕形成，并得到令人鼓舞的结果。
[0008]TGF-B3主要以间充质起源的细胞产生为主，分子量为12.5KDa，可通过真原核细胞表达,其主要的生物学功能主要包括:诱导如成纤维细胞等的间质细胞等的间质细胞增生和分化；促进细胞外基质(ECM)的形成、加快伤口愈合；抑制包括上皮细胞、内皮细胞及淋巴细胞等的增殖与分化；抑制免疫反应、防止肿瘤的发生和恶变等方面。鉴于此，TGF-B3现已成为细胞因子家族药物中研发的热点之一，已有研究报告利用原核和真核表达系统来表达TGFB3蛋白。利用真核表达系统表达rhTGFB3量低，操作复杂，成本高，并不利于工业化生产；而大肠杆菌表达rhTGFB3蛋白时以包涵体形式存在，因其复杂的二硫键配对导致的分离纯化和复性问题，故难以获取活性蛋白。
【发明内容】
:
[0009]本发明在已构建rhTGF.B3原核表达质粒并成功表达rhTGF_B3的基础上，旨在建立一条rhTGF-B3纯化、复性和生物学活性测定的工艺流程，为rhTGF_B3蛋白的大规模生产提供了一种经济可行的方法，解决现有技术分离纯化复姓困难的缺陷，提供一种高活性的TGFB3.
[0010]本发明提供一种纯化重组TGF-B3的方法，该方法是由如下步骤组成，具体为:包涵体的收集和洗涤；包涵体的溶解；变性蛋白的纯化；单体蛋白的复性；复性蛋白的纯化；
【具体实施方式】
:
[0011]实施例1:
[0012]1.包涵体的收集与洗涤
[0013]离心收集菌体，重悬于3倍(V/w)的超声破碎缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.010mmol/L EDTA, lOOmmol/L NaCl);每 g 菌体(湿重)加 51xl100mmol/LPMSF和 Img溶菌酶，磁力搅拌30rain。然后，加入脱氧胆酸钠(DOC)干粉，使其终浓度为2 %，磁力搅拌30min后进行超声破碎。破碎后的菌液先用1500r/min离心10min，收集上清；再6500r/min离心14min，收集包涵体沉淀。然后依次按10倍(V/w)的比例加入包涵体洗涤液1、2、3、4进行洗漆，每次洗漆均先在均质机中均衆30min,再于4.?,6500;τ/η?η,离心14min,回收沉淀。包涵体洗涤液 I (50mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.0，5mmol/L EDTA, lmol/LNaCl, 0.05% TritonX-100,5% glycerol);洗涤液2 (50mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5mmol/L EDTA，0.lmol/LNaCl, 0.05%TritonX-100, 5% glycerol);洗漆液3 (5mmol/L EDTA, 0.lmol/L NaCl, 0.lmol/L HAc, 4molUrea);洗漆液 4(5mmol/L EDTA,0.lmol/LNaCl,0.lmol/L HAc)。
[0014]2包涵体的溶解
[0015]洗漆后的包涵体按10倍(V/w)比例加入预溶解液(50mmol/L K2HPO4, lmmol/LEDTA, ImmoL PMSF, 10mmoI/L DTr)。高速匀浆30min后，加入4倍体积的10%乙酸，混匀；再加入尿素至终浓度为8mol/L。磁力搅拌30min后，室温13000r/min离心20min,收集上清；用10倍体积的去离子水稀释上清液，并调PH4.0左右。
[0016]3.变性蛋白的纯化
[0017]用10Ommol /T, HAc-NaAc pH4.0 溶液平衡 CMSepharosel Fast Flow 层析(16X200mm)，然后将调好pH的上清液进行上样，分别用洗脱液I (2mol/L NaCl，用0.5mol/L NaOH调至ρΗ8.5)、洗脱液2(2mOl/LNaCl，0.5mOl/L L-Arg)洗脱，收集各洗脱峰，并进行SDS-PAGE (15% )检测。
[0018]4.单体蛋白的复性
[0019]将CM柱收集的目的蛋白，加入DTr至终浓度为100mmol/L，磁力搅拌过夜，过滤后收集滤液，用缓冲液(0.2mol/L NaCl,0.2mol/L L.Arg)平衡Sphacryl S-100凝胶过滤层析(26x1000mm)，后，将滤液上样后用相同的缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰，并进行SDS-PAGE (15% )检测。单体蛋白的复性取Img单体蛋白逐滴滴加到50ml复性液中[lmol/L NaCl、0.5mol/L-Arg、0.5mmol/L GSSG、30mmol/L CHAPS,20% (v/v) DMSO]，4 ~10°C磁力搅拌48h。
[0020]5.复性蛋白的纯化:
[0021]用缓冲液(20m mol/LTris-HC I, pH7.6)平衡 DEAE Sepharosel Fast Flow 柱(16X200mm)后，将含复性蛋白的溶液进行上样，分别用洗脱液I (2moI/LNaCl，20mmoI/LTris-HCl, ρΗ7.6)、洗脱液 2 (2mol/L NaCl, 200mmol/L sodium citrate, pH4.0)洗脱，收集各洗脱峰，并进行SDS-PAGE(15% )检测；将收集到的含复性蛋白的洗脱峰用SphacrylS-100凝胶过滤层析(26x1000mm)再进行聚合体的分离，并进行SDS-PAGE(15% )检测，平衡液以及洗脱液均为 50mmol/L sodiumcitrate, 200mmol/L NaCl, ρΗ4.0 的缓冲液。
[0022]实施例2
[0023]I..生物活性测定
[0024]重组蛋白的活性测定采用MTT方法测定:用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的Balb/c3T3细胞，用含10% FBS的RPMI1540培养基配成单个细胞悬液，以每孔5X100个细胞接种至96孔板中，待完全贴壁后加入5X103样品，同时以2 %的1640溶液设为空白对照。培养48h后，每孔加入20MTT溶液(5mg/ml)，37°C孵育4h，小心吸取上清后，每孔加入DMS0150ul，振荡lOmin，使结晶物充分溶解。以490nm波长，在酶联检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果表1:
[0025]
【权利要求】
1.一种重组人转化生长因子TGFB3的制备方法，其特征在于包含: 包涵体的收集和洗涤； 包涵体的溶解； 变性蛋白的纯化； 单体蛋白的复性； 复性蛋白的纯化。
2.根据权利要求1所述的包涵体的收集和洗涤，其特征在于洗涤液包括: 涤液 I 50mmol/L Tris-HCl,5mmol/LEDTA,lmol/LNaCl,0.05 % TritonX-100,5 %glycerol ； 洗涤液2 50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA，0.1mol/LNaCI，0.05% TritonX-100，5%glycerol ；
洗f条液 3 5mmol/L EDTA，0.lmol/L NaCl，0.lmol/L HAc，4mol Urea ； 洗绦液 4 5mmol/L EDTA，0.1mol/LNaCI,0.lmol/L HAc 组成。
3.根据权利要求1，2所述的洗涤液，其特征在于该洗涤液的使用顺序按照由1-4的顺序依次进行。
4.根据权利要求1所述的包涵体的溶解，其特征在于其溶解液是由50mmol/LK2HPO4,EDTA, ImmoL PMSF，10mmoI/L DTr 组成。
5.根据权利要求1，4所述的溶解液，其特征在于EDTA的浓度为lmmol/L。
6.根据权利要求1所述的单体蛋白的复性，其特征在于复性液是由NaCl、L-Arg、GSSG、CHAPS,20% (v/v) DMSO 组成。
7.根据权利要求1.6所述的复性液，其特征在于L-Arg的浓度为0.5mol/L。
8.根据权利要求1.6所述的复性液，其特征在于GSSG的浓度为30mmol/L。
9.根据权利要求1所述的复性蛋白的纯化，其特征在于所用的纯化柱是SepharoselFast Flow 柱。
【文档编号】C07K1/16GK104163863SQ201310182505
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】董佳里, 张宝华 申请人:天津博发生物技术有限公司, 成都博发生物技术有限公司
文档序号 :
【 3482656 】
技术研发人员：董佳里,张宝华
技术所有人：天津博发生物技术有限公司,成都博发生物技术有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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