一种抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法及其应用。
背景技术：
人类血清/浆等生物样品中含有机体组织细胞分泌、脱落至血中的多种低丰度蛋 白质，它们可能是一些信号传导和调控的关键蛋白。例如，坏死、凋亡或溶血过程中，都会有 一些细胞内蛋白质释放到血中。开展疾病的血清蛋白质组学研究，寻找低丰度蛋白质，将有 利于阐明发病机理，并有可能发现一些与疾病特定状态相关的标志性蛋白质，从而为疾病 的诊断提供新方法。然而一些高丰度蛋白质的存在，尤其是白蛋白和抗体，严重影响了低丰 度蛋白质的鉴定和检测。 蛋白质组学研究中常利用抗体亲和层析法去除样品中的高丰度蛋白质，以提高对 低丰度蛋白检测的灵敏度和分辨率。利用抗体亲和层析去除技术的关键是得到特异性高 且廉价易得的抗体，而现在抗体亲和层析法多采用哺乳动物来源的重组单克隆或多克隆抗 体。 一般使用兔，鼠等哺乳动物作为产生抗血清/血浆中高丰度蛋白抗体的动物来源。哺 乳动物的单克隆抗体制备较复杂，产量小，成本高；其来源于血浆的多克隆抗体同样存在上 述问题，且会存在非特异性结合的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人血清/浆中高丰度蛋白抗体的制备方法及其应 用，其解决了现有技术中使用兔，鼠等哺乳动物作为产生抗血清/血浆中高丰度蛋白抗体 的动物来源，使用哺乳动物血清作为提取抗体来源，致使抗体的制备步骤复杂，产量小，成 本高，抗体有非特异性结合，效价低且不稳定等问题；并且解决了哺乳动物来源抗体在蛋白 分离，提取中引起的非特异性分离问题。解决了哺乳动物来源抗体在免疫学检测中非特异 性吸附而导致的杂信号影响问题。 本发明解决上述问题的思路是禽类在种系发生上具有和哺乳动物更远的亲缘关 系，可针对哺乳动物进化中大量保守蛋白抗原产生具有更高特异性的抗体，且产生有效免 疫反应所需抗原量小。使用经免疫后母鸡的蛋，取代动物血清，作为提取抗体的来源。近 年来，卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk，简称IgY)，因产量大、特异性强、获取方 便、成本低等优点，越来越多的应用于疾病的诊断、预防和治疗，成为一种稳定可靠的抗体 来源。抗人血浆高丰度蛋白的特异性IgY可共价结合于固体支持物，去除血浆中的高丰度 蛋白，如白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白(IgA、 IgM、 IgG)等。
本发明解决上述问题的技术方案是所提供的一种抗人血清/浆中高丰度蛋白抗 体IgY的制备方法包括以下步骤 1 、收集经过高丰度蛋白免疫后母鸡所产的含高效价抗体的鸡蛋。所述含高效价抗 体的鸡蛋是这样确定的用间接ELISA法检测经过高丰度蛋白免疫后母鸡血清的效价，效价达标后即为高效价抗体鸡蛋； 2、从高效价抗体鸡蛋中分离提取高丰度蛋白卵黄抗体IgY :将所述的高效价抗体鸡蛋的卵黄液经酸性水溶解，冻融，过滤，硫酸铵沉淀和DEAE阴离子交换层析即可分离得到纯化的高丰度蛋白卵黄抗体IgY。 步骤2高丰度蛋白卵黄抗体的分离提取，其步骤是 (1)去除高效价鸡蛋的蛋白和卵黄膜得到卵黄液，用超纯水稀释卵黄液，按超纯水与卵黄液l : 2-1 : 15的体积比，调整稀释液的pH在4. 5-6.0范围，4t:搅拌9h至过夜。将卵黄稀释液冻存后，置于4t:缓慢溶解，过滤。滤液经11000rpm离心20min，收集上清。
(2)上述上清液用饱和硫酸铵沉淀2次，最终浓度分别为50%和35% 。 11000rpm离心25min，弃上清，沉淀用PBS溶解。4t:透析24h，中间换液4次。透析得卵黄抗体粗品。
(3)用DEAE阴离子交换柱在6. 8 7. 0的近中性环境下对卵黄抗体进行纯化，lmol/L NaCl梯度洗脱，流速lmL/min。收集洗脱液，即为卵黄抗体溶液。
步骤1对经过免疫后母鸡的血清进行效价检测，获取含高效价抗体的鸡蛋，其步骤是 (1. 1)用间接ELISA法检测免疫血清效价，用酶标仪检测450nm的光吸收值，以阳性血清450nm的光吸收值大于阴性对照平均值2. 1倍时的血清最低稀释度为ELISA效价。
(1. 2)用间接ELISA法检测免疫血清效价，ELISA效价达1 : 10000后收取鸡蛋，
4t:保存。 本发明中所述高丰度蛋白为白蛋白，IgG，转铁蛋白，C3补体，IgA， IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂蛋白，F因子，C9补体，C4补体，铜蓝蛋白，载脂蛋白B，载脂蛋白A-l， ci-l-酸性糖蛋白，H因子，补体因子B，前白蛋白，Clq补体等浓度高于10iig/ml的高丰度蛋白。
本发明中抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY应用包括高丰度蛋白的免疫亲和提取、高丰度蛋白的免疫亲和分离，高丰度蛋白的免疫学检测。
本发明的优点是 1、制备高丰度蛋白卵黄抗体IgY时，收集蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。 2、抗体产量高，维持在高效价的时间长，成本低廉。产蛋禽类经免疫后，很快就可在蛋中产生较高效价，且维持时间长。卵黄抗体产量大，每个蛋大约含100mg以上的IgY，一个月可达3g，相当于兔子的10-12倍。由于禽类的饲养费用低廉，并可长时间产生高效价抗体，其成本远远低于从哺乳动物血浆中提取到相应抗体。 3、抗体分离提取方便且纯度高。卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。利用硫酸铵沉淀法分离到的IgY粗品纯度就达90%以上。 4、 IgY更稳定，易于储存。由于受到卵黄的保护，蛋贮存在fC条件下6个月，IgY活性只有很小损失。而且，IgY较哺乳动物抗体更耐酸，耐碱，耐热。 5、卵黄抗体对哺乳动物来源的蛋白抗原产生的效价高，特异性强，且产生有效免疫反应所需抗原量小。 6、抗高丰度蛋白的卵黄抗体应用于高丰度蛋白的免疫亲和提取、高丰度蛋白的免疫亲和分离，高丰度蛋白的免疫学检测。解决了高丰度蛋白的免疫亲和提取、高丰度蛋白的免疫亲和分离，高丰度蛋白的免疫学检测中的非特异性问题。
图1为卵黄抗体IgY分离提取SDS-PAGE电泳图，泳道1为纯化得到的高丰度蛋白IgY，泳道2为高丰度蛋白IgY标品。
具体实施例方式
实施例1为抗转铁蛋白鸡的IgY制备过程 1、对经过转铁蛋白免疫后母鸡的蛋进行检测，获取含高效价抗体的鸡蛋。具体步骤是 (1)用间接ELISA法检测免疫血清效价，用酶标仪检测450nm的光吸收值，以阳性血清450nm的光吸收值大于阴性对照平均值2. 1倍时的血清最低稀释度为ELISA效价。
(2)用间接ELISA法检测免疫血清效价，ELISA效价达l : 10000后收取鸡蛋，4°C保存。 2、从高效价抗体鸡蛋中分离提取高丰度蛋白卵黄抗体IgY :将所述的高效价抗体鸡蛋的卵黄液经酸性水溶解，冻融，过滤，硫酸铵沉淀和DEAE-fast-flow离子交换层析即可分离得到纯化的高丰度蛋白卵黄抗体IgY。具体步骤是 (l)去除高效价鸡蛋的蛋白和卵黄膜得到卵黄液，用超纯水与卵黄液l : 9的体积比稀释卵黄液，将稀释液调整到ra = 5. 5左右，4t:搅拌9h至过夜。将卵黄稀释液冻存后，置于4t:缓慢溶解，过滤。滤液经llOOOrpm离心20min，收集上清。 (2)上述上清液用饱和硫酸铵沉淀2次，最终浓度分别为50%和35% 。 11000rpm
离心25min，弃上清，沉淀用PBS溶解。4t:透析24h，中间换液4次。透析得卵黄抗体粗品。 (3)用DEAE阴离子交换柱在6. 8 7. 0的近中性环境下对卵黄抗体进行纯化，
lmol/L NaCl梯度洗脱，流速lmL/min。收集洗脱液，即为卵黄抗体溶液。 (4)从图1可以看出，泳道1和泳道2中，在相同位置出现相同条带，说明提取得到
了卵黄抗体IgY。 实施例2为抗白蛋白鸡的IgY制备过程 1、对经过白蛋白免疫后母鸡的血清进行效价检测，获取含高效价抗体的鸡蛋。具体步骤是 (1)用间接ELISA法检测免疫血清效价，用酶标仪检测450nm的光吸收值，以阳性血清450nm的光吸收值大于阴性对照平均值2. 1倍时的血清最低稀释度为ELISA效价。
(2)用间接ELISA法检测免疫血清效价，ELISA效价达l : 10000后收取鸡蛋，4°C保存。 2、从高效价抗体鸡蛋中分离提取高丰度蛋白卵黄抗体IgY :将所述的高效价抗体鸡蛋的卵黄液经酸性水溶解，冻融，过滤，硫酸铵沉淀和DEAE离子交换层析即可分离得到纯化的高丰度蛋白卵黄抗体IgY。 (l)去除高效价鸡蛋的蛋白和卵黄膜得到卵黄液，用超纯水与卵黄液l : 9的体积比稀释卵黄液，将稀释液调整到ra = 5. 5左右，4t:搅拌9h至过夜。将卵黄稀释液冻存后，置于4t:缓慢溶解，过滤。滤液经llOOOrpm离心20min，收集上清。 (2)上述上清液用饱和硫酸铵沉淀2次，最终浓度分别为50%和35% 。 11000rpm
5离心25min，弃上清，沉淀用PBS溶解。4t:透析24h，中间换液4次。透析得卵黄抗体粗品。 (3)用DEAE阴离子交换柱在6. 8 7. 0的近中性环境下对卵黄抗体进行纯化，
lmol/L NaCl梯度洗脱，流速lmL/min。收集洗脱液，即为卵黄抗体溶液。 (4)从图1可以看出，泳道1和泳道2中，在相同位置出现相同条带，说明提取得到
了高纯度的卵黄抗体IgY。
权利要求
一种抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于所述制备过程包括以下步骤(1)收集经过高丰度蛋白免疫后母鸡所产的含高效价抗体的鸡蛋。所述含高效价抗体的鸡蛋是这样确定的用间接ELISA法检测经过高丰度蛋白免疫后母鸡血清的效价，效价达标后即为高效价抗体鸡蛋；(2)从高价效抗体鸡蛋中分离提取抗高丰度蛋白卵黄抗体IgY将所述高效价抗体鸡蛋的卵黄液经酸性水稀释，经冻融，过滤得到含卵黄抗体IgY的水溶液，硫酸铵沉淀粗纯，DEAE离子交换层析即可分离得到纯化的高丰度蛋白卵黄抗体IgY。
2. 根据权利要求1所述的抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法，其特 征在于步骤(2)所述高丰度蛋白卵黄抗体IgY的分离提取，其步骤是(2. 1)去除高效价鸡蛋的蛋白和卵黄膜得到卵黄液，用超纯水稀释卵黄液，按卵黄液与 超纯水l : 2-1 : 15的体积比，并将稀释液调整pH在4. 5-6.0范围，4t:搅拌9h至过夜。 将卵黄稀释液冻存后，置于4t:缓慢溶解，过滤。滤液经11000rpm离心20min，收集上清即 为含卵黄抗体IgY的水溶液。(2. 2)含卵黄抗体IgY的水溶液上清用饱和硫酸铵沉淀2次，终浓度分别为50%和 35%。 11000rpm离心25min，弃上清，沉淀用PBS溶解。4"透析24h，中间换液4次。透析 得到卵黄抗体粗品。(2. 3)用DEAE阴离子交换柱在pH 6. 8 7. 0的近中性环境下对卵黄抗体进行纯化， lmol/L NaCl梯度洗脱，流速lmL/min。收集洗脱液，得到卵黄抗体溶液。
3. 根据权利要求1所述的抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法，其特 征在于步骤(1)对经过高丰度蛋白免疫后母鸡血清效价进行检测，获取含高效价抗体的 鸡蛋，其步骤是(1. 1)用间接ELISA法检测免疫血清效价，用酶标仪检测450nm的光吸收值，以阳性血 清450nm的光吸收值大于阴性对照平均值2. 1倍时的血清最低稀释度为ELISA效价。(1.2)用间接ELISA法检测免疫血清效价，ELISA效价达1 : 10000后收取鸡蛋，4t:保存。
4. 根据权利要求1-3任一所述的抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方 法，其特征在于制备出的抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY用于高丰度蛋白的提 取，分离，免疫学检测。
5. 根据权利要求1-3任一所述的抗人血清/浆中高丰度蛋白抗体IgY的制备方法，其 特征在于所述高丰度蛋白为白蛋白，IgG，转铁蛋白，C3补体，IgA， IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂 蛋白，F因子，C9补体，C4补体，铜蓝蛋白，载脂蛋白B，载脂蛋白A-l， a -1-酸性糖蛋白，H 因子，补体因子B，前白蛋白，Clq补体等浓度高于10iig/ml的高丰度蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种抗人血清/浆高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法及其应用，本发明用经过高丰度蛋白免疫后母鸡的蛋作为提取抗体的来源。制备步骤是对经过免疫后的母鸡以间接ELISA法检测血清效价，效价达标后，获取含高效价抗体的鸡蛋。将鸡蛋卵黄液经酸性水解，冻融，过滤后，硫酸铵沉淀。最后再经过DEAE离子交换层析进一步纯化得到卵黄抗体IgY。人血清/浆高丰度蛋白是指白蛋白，IgG，转铁蛋白，C3补体，IgA，IgM，胰蛋白，珠蛋白，脂蛋白，F因子，C9补体，C4补体，铜蓝蛋白，载脂蛋白B，载脂蛋白A-1，α-1-酸性糖蛋白，H因子，补体因子B，前白蛋白，C1q补体等浓度高于10μg/ml的高丰度蛋白。
文档编号C07K1/22GK101724069SQ20091025443
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者崔亚丽, 胡佳, 陈超 申请人:陕西北美基因股份有限公司
文档序号 :
【 3565580 】
技术研发人员：崔亚丽,胡佳,陈超
技术所有人：陕西北美基因股份有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术所有人：陕西北美基因股份有限公司
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