制备默诺霉素a的方法
技术领域：
本发明涉及从微生物培养液中分离默诺霉素A的方法。
默诺霉素及其许多衍生物很早以前就已知了(参考DE-A 3704659，EP 0355 679，G.Huber在“Antibiotics”中，F.Hahn编，Springer Verlag，柏林1979，IV卷，135页以后，Welzel等人在四面体中，1983，39卷，9期，1583-1591)。默诺霉素例如默诺霉素A优选通过微生物发酵及随后纯化得到。
为本专利申请的目的，术语默诺霉素指默诺霉素组分(如微生物产生的)复合物以及单个的组分，默诺霉素A为默诺霉素复合物中具有特殊抗生素活性的组分。
该默诺霉素A具有下面结构式
除默诺霉素A外，主要组分为A11，A12，C1，C2，C3和C4组分。
产生默诺霉素复合物的微生物实施例为班堡链霉菌，加纳链霉菌，埃德链尔霉菌和喷泉链霉菌。特别优选班堡链霉菌(关于这点参见Huber在上述引文中)。
最近已发现默诺霉素，尤其是默诺霉素A，适于控制幽门螺旋杆菌感染(HOE，93/F 392)。幽门螺旋杆菌感染是人类胃炎和溃疡的主要原因。
虽然默诺霉素复合物适于作为人用药，但由于依赖发酵的微生物原因导致的组分组成变化，剂量成问题。为此，对仅用单一化合物(单组分)作为活性物质来说人用药中活性成份存在着变化。
根据“抗微生物药与化疗”1965，737，可通过硅胶柱色谱及分离后用丙醇/氨混合物洗脱从默诺霉素复合物中分离四种组分A，B1，B2和C，它们也可在正丙醇/2N NH3(70∶30)体系中色谱展开后在薄层色谱上检测并通过用氯磺酸/冰醋酸喷雾定位且具有不同RF值的分离斑。默诺霉素组分彼此在化学上非常近似，在溶解性、酸性、颜色反应和纸色谱和纸电泳行为方面默诺霉素复合物未表现出差别。它们彼此区别在于硅胶色谱行为及组分B1和B2无特征性UV吸收。
最近通过使用逆相(RP)色谱如在LiChroprepRP-18上将组分进行了分离(J.Scherben beck等人，四面体，49卷，15期，3091-3100，1993)。
然后，这些实验室方法无一适用于工业分离默诺霉素组分硅胶色谱已过时，因为它难于重复应用载体且价格昂贵，逆相色谱法需要非常高的花费，其它分离方法如离子交换剂的使用至今还是不成功的，因为其不足以将默诺霉素A组分与C组分分离。专利GB 1068639和DE1236726记载了在纤维素基的离子交换剂上纯化默诺霉素复合物的方法，然而该纯化方法不适于分离各种组分。另外，该方法难用于工业规模，主要由于纤维素载体对压力的感性。德国专利1617 466报导了在强碱性聚苯乙烯基的离子交换剂上分离默诺霉素D、E、F、C和H的方法。然而由于缺乏选择性，所述方法不适于纯化默诺霉素A组分。因而不足以把A组分和C组分分离开。
现在令人惊奇地发现默诺霉素A可借助于阴离子交换色谱法低成本大规模地从默诺霉素复合物中分出。
因此本发明涉及制备默诺霉素A的方法，该方法是通过产生默诺霉素的微生物的发酵，随后用色谱法将培养基滤液的其它组分与默诺霉素A分离开，其中阴离子交换剂用作色谱材料。
优选的阴离子交换材料为改性的二乙基氨基乙基作功能基的甲基丙烯酸酯共聚物。
特别适合的阴离子交换材料为产品Toyopearl DEAE-650S(TOSOHAAS，Montgomeryville，PA 18936 USA)或Fractogel TSKDEAE-650S(E、Merck，Darmstadt)。
本发明色谱法可在PH5-9，优选PH7-8之间进行。在该PH范围有效的许多缓冲体系适用于分离，例如磷酸盐，柠檬酸盐，tris/HCl缓冲体系或其它缓冲体系等。
采用不断增加的盐梯度，优选0-4，特别是0-2摩尔浓度梯度从阴离子交换剂中洗脱(脱附)默诺霉素组分。特别适合的盐为NaCl和KCl。
还可以使用不断下降的PH梯度，优选从PH9到PH3，尤其是从PH8到PH4.5。
可用已知方法从作为缓冲剂的1/15M Na2HPO4(-PH 8)开始，线性变化到1/15 MKH2PO4(-PH 4.9)产生这种类型PH梯度。
适当时，也可用含一定比例有机溶剂的缓冲体系实现阴离子交换剂上的分离。可使用的实例为脂族醇如浓度为0-95％，优选15-40％的甲醇、乙醇、丙醇或其它醇。离子交换剂能力随有机溶剂浓度增大而下降，因此也可用有机溶剂百分比增加的梯度洗脱默诺霉素组分。在默诺霉素组分中，默诺霉素A与本发明载体结合最弱，结果该化合物首先洗脱分离。
根据本发明，借助阴离子交换剂预先纯化培养基滤液对分离默诺霉素A是有利的。可用中性吸附树脂进行预纯化。合适中性吸附树脂的实例为Mcl GEL CHP 20P和DIAIONHP 20SS(Mitsubishi化学公司)或AmberliteXAD 16和XAD 1180S(Rohm&Hass)。这使培养基滤液与吸附树脂接触，从萃取的培养基滤液中分离负载的树脂，用有机溶剂在水中的混合物按已知方法洗脱(脱附)抗生素。在中性吸附树脂上的这种预纯化方法从粗默诺霉素中除去盐和脂类，并浓缩了粗默诺霉素，这样对离子交换步骤的分离效率是有益的。
另一种预纯化的方法在于用非极性溶剂萃取培养基滤液，适当时以浓缩或干燥形式，在这情况下非极性杂质溶于非极性溶剂中。适当的非极性溶剂的实例为石油醚，丙酮，甲乙酮等。然后可用极性溶剂如甲醇从余下的培养基滤液中萃取默诺霉素复合物。适当时可通过例如蒸馏、超滤、喷雾干燥或冷冻干燥法浓缩或干燥培养基滤液。
为了更有效地用极性溶剂萃取，可向培养基滤液中加入螯合剂如EDTA，柠檬酸等。螯合剂降低了与默诺霉素形成在极性溶剂中低溶解度的盐的多电荷离子浓度。
浓缩默诺霉素或默诺霉素A的优选方法描述在实施例1和2中。
在改性甲基丙烯酸酯共聚物DEAE载体上预纯化和分离组分形成含盐默诺霉素A溶液，其可被少量其它成分污染，尤其是默诺霉素A12。根据分离组分柱中洗脱的组成，默诺霉素A的纯度为90-大于99％。为了最终纯化，降低残余其它组分浓度并除去盐，再除去中性吸附树脂如优选的Mcl Gel CHP 20 P，或DIAIONHP 20SS或AmberliteXAD 16或XAD 1180S是有利的。用含水缓冲液/有机溶剂混合物如磷酸盐缓冲液/异丙醇混合物在这类树脂上分馏可实现默诺霉素A的基本纯化。这样，仅不完全浓缩的默诺霉素A即可纯化到大于99％的纯度。足以在PH4和10之间，优选PH7和9之间缓冲的许多缓冲物质是合适的。
适合的有机溶剂为水混溶的溶剂如低级醇、丙酮、乙腈等。
用所述中性吸附树脂可从含盐默诺霉素A溶液中除去盐。在PH值为7和9之间负载后，通过不断增加与水混溶有机溶剂中有机溶剂比例的水进行洗脱。收集具有足够纯组分的含默诺霉素A的柱洗脱物，然后超过滤或蒸馏，优选真空下浓缩，干燥。按这种方式得到的默诺霉素A纯度大于97％。存在的主要杂质为默诺霉素组分A12。
如果希望制备较高百分比含量的默诺霉素A，可以重复离子交换色谱的纯化步骤和在吸附树脂上的组分纯化步骤。所得默诺霉素纯度为＞99％。根据为分离所选的盐和缓冲剂，可得到的抗生素盐为钠盐、钾盐、铵盐或为其它盐。优选的反离子(阳离子)可自由选择，取决于药物要求。
下面实施例和权利要求书的内容详细解释本发明。
实施例1用固相萃取浓缩培养基滤液中的默诺霉素用基于K.H.Wallhauser等人、抗微生物药与化学治疗，1965，734-736页中的方法发酵加纳链霉菌的变异体(ATCC 146 72)，用Simex压滤器过滤，用去离子水洗，并通过KS 80多层滤器澄清过滤，得到1100升含默诺霉素的培养基滤液。固体含量-20克/升，有2.8克默诺霉素A。导电率14mS/cm，pH7.5。含3千克固体和420克默诺霉素A的150升装到容量为58升(宽×高＝33.3厘米×66厘米)且填充MClGel CHP 20P吸附树脂的柱上。流速2.5升/分钟。吸附后，用水中含0-40％异丙醇的梯度洗脱剂以10升/分钟的流速洗脱。合并主要含默诺霉素A的馏分，超过滤浓缩，干燥。得到0.7千克默诺霉素复合物。
实施例2用选择性溶解来浓缩培养基滤液里的默诺霉素用“UF-36-9工业控制装置”(DOS)通过超过滤将实施例1制备的1000升培养基滤液浓缩至140升。所用膜为9m2Nadir PA 20H层。超滤率(流速率)为28升/m2/小时。当保留物容物达到140升时，用总共140升去离子水连续洗浓缩物。在这期间浓缩积导电率降至1.8mS/cm。在保留物(140升)中默诺霉素复合物的最终浓度为32.9克/升，pH为6.9。喷雾干燥保留物。超过滤液(渗透液)含24mg默诺霉素/升，共24克，相当于实际量的0.52％。终产物(干燥的保留物)为灰棕色粉末，重15千克，含2.8千克默诺霉素A(所用A组分的99％)。
用50升丙酮搅拌3千克喷雾干燥的产物，离心。有机萃取液含1.02千克酯类。用20升甲醇搅拌不溶残余物3次，每次1小时，然后滤出。默诺霉素A(0.54千克)存在于甲醇相。除去甲醇的该物质(1.1千克)1％浓度溶液导电率为1mS/cm。真空浓缩及用水稀释后，甲醇萃取液可直接用于分离组分。
实施例3用离子交换法分离默诺霉素组分A和C
1千克默诺霉素复合物溶于20升水(pH7.4)中，然后装到填充20升在pH7.4平衡的FractogelTSK DEAE-60阴离子交换剂的柱上。首先用缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，2.5mS+20％2-丙醇)洗，然后使用从缓冲液A到缓冲液B(＝缓冲液A中的1M NaCl)的线性梯度洗。在该试验中流速为7升/分钟，相当于每小时21个柱容积，馏分体积为20升(-1个柱容积)。通过超过滤和干燥从主要含默诺霉素A的馏分中除去盐后，分离得到480克组分A，纯度为95％。默诺霉素组分的回收率为90％以上。
实施例4在吸附树脂上除去用阴离子交换剂分离的默诺霉素A的盐溶于7升缓冲剂水溶液pH7.9，10.5mg/cm的81克95％纯度的默诺霉素A，在DEAE纯化和超过滤后，装到容量为2.7升(宽×高＝10厘米×35厘米)且填充MCl-GelCHP 20P的柱上。用水中含0-35％异丙醇的梯度进行洗脱。合并含97％默诺霉素A的馏分，超滤浓缩，冷冻干燥、除24克88％纯材料外，得到55克98.5％纯度的默诺霉素A。
实施例5在MCl Gel CHP 20P吸附树脂上再纯化默诺霉素A溶于7升pH7.9，导电率10.5mS/cm缓冲水溶液中的81克95％纯度默诺霉素A，在DEAE纯化和超过滤后，装到容量为2.7升(宽×高＝10厘米×35厘米)且填充MCl GelCHP 20P的柱上。用缓冲液A(m/15磷酸盐缓冲液，pH7.8)到缓冲液B(m/15磷酸盐缓冲液，pH7.8，含33％2-丙醇)的线性梯度进行洗脱。分馏并分析柱流量。收集含至少98.8％纯度默诺霉素A的馏分，按实施例4中所述除去盐后，干燥，得到71克99.3％纯度的默诺霉素A，含0.4％污染物默诺霉素A12。
权利要求
1.一种通过发酵产生默诺霉素的微生物及随后用色谱法将培养基滤液的其它组分与默诺霉素A分离来制备默诺霉素A的方法，其中阴离子交换剂用作色谱材料。
2.权利要求1中所要求的方法，其中阴离子交换材料为改性的二乙基氨基乙基作为功能基的甲基丙烯酸酯共聚物。
3.权利要求1或2中所要求的方法，其中使用从0到4摩尔不断增大盐含量的盐溶液作为洗脱剂。
4.权利要求1-3中一个或多个所要求的方法，其中使用PH从9到3的溶剂作为洗脱剂。
5.权利要求1-4中一个或多个所要求的方法，其中在阴离子交换色谱前，先在中性吸附树脂上用色谱法纯化培养基滤液。
6.权利要求1-5中一个或多个所要求的方法，其中在阴离子交换色谱前，先通过用非极性溶剂萃取预纯化培养基滤液。
7.权利要求1-6中一个或多个所要求的方法，其中在中性吸附树脂上至少用另一步色谱法再次纯化所得的默诺霉素A。
全文摘要
默诺霉素A可通过发酵产生默诺霉素的微生物及随后用色谱法将培养基滤液其它组分与默诺霉素A分离而得到制备,其中使用阴离子交换剂作为色谱材料。
文档编号C12P19/44GK1196356SQ98106948
公开日1998年10月21日 申请日期1998年4月16日 优先权日1997年4月17日
发明者L·沃特希, A·斯塔克, E·艾勒斯 申请人:赫彻斯特股份公司
文档序号 :
【 550474 】
技术研发人员：L.沃特希,A.斯塔克,E.艾勒斯
技术所有人：赫彻斯特股份公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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