一种制备纳他霉素的方法
专利名称：：一种制备纳他霉素的方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备纳他霉素的方法。技术背景纳他霉素(Natamycin)是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，也称游霉素或匹马霉素(Pimaricin)，它由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成，能够专性抑制酵母菌和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉素的形成。其实际使用剂量为10—6数量级，具有低剂量、高效率，抗菌作用时间长的特点，是一种高效、安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂，目前已在30多个国家广泛使用，包括欧盟、大部分北美和东欧国家以及一些中东国家，甚至瑞士这样对食品安全非常重视的国家也允许在面包和奶酪产品中使用纳他霉素。1996年我国食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，1997年3月，我国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂，其商品名称为霉克(NatamycinTM)。纳他霉素对几乎所有的霉菌和酵母菌具有抗性，抑菌作用比山梨酸强50倍左右，且连续数年使用也不易引起靶标真菌形成抗性，但对细菌和病毒无效。因此它在以细菌发酵为基础的食品行业有着广泛的应用前景。作为食品防腐剂，可应用于果酱、黄油、桔汁、生肉和沙拉酱等的防霉，延长食品的保质期，防止酵母和霉菌引起的霉变，减少因为变质而引起的食品回收，降低生产成本，且不改变食品的风味，满足消费者对天然食品的要求。纳他霉素也可以作为医学上的高效抗菌剂，对口腔念球菌感染，真菌性眼角膜溃疡，角膜炎，皮肤及粘液膜真菌感染等疾病都有很好的治疗效果。随着研究的不断深入，纳他霉素的应用范围正在继续扩大，发挥着越来越大的作用。利迪链霉菌(S^repz^^ces7y力'cwsDeBoeretal.)是习居于土壤的腐生微生物，研究历史悠久，已知有许多菌株在代谢过程中能够产生各种抗菌活性物质。其著名的代表菌株是S.7j^/icMNRRL2433，该菌株在医药领域研究和应用广泛，可产生具有广谱抗细菌和分枝杆菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗革兰氏阳性细菌和分枝杆菌的利迪链菌素(Str印tolydigin);另外有产生抗少数大肠杆菌和克氏肺炎杆菌的苹果酸氧霉素(Malioxamycin)的&7y^'c^1574，以及产生抗革兰氏阳性细菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的抗生素Lydicamycin的菌株。
发明内容本发明的目的是提供一种制备纳他霉素的方法。本发明所提供的制备纳他霉素的方法，是发酵利迪链霉菌(5Yr印"/^c^"&'CM)得到纳他霉素。所述禾U迪链霉菌(5Yrep"/HycesJ70^cws)可为禾廿迪链霉菌(5Yre/^o/HycesJ7力'cws)AOlCGMCCNo.1653或利迪链霉菌(5"z^印t咖yces7;^/icws)A02CGMCCNo.1654。利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653是从北京密云县蔬菜田土壤中分离筛选获得，利迪链霉菌A02CGMCCNo.1654是从北京远郊天然次生林土壤中分离筛选得到的。其已于2006年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号分别为CGMCCNo.1653和CGMCCNo.1654。其中，发酵所述利迪链霉菌(6Yrepfo/^ces7yA'cw50AOlCGMCCNo.1653的发酵培养基的组成为每升培养基中含有黄豆粉2%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉O.5%，葡萄糖2%，玉米浆O.25%，(NH4)2S040.25%，MgS04.7H200.025%，K2HP040.002%，NaClO.4%，CaCO30.2%，其余为水；所述利迪链霉菌A01CGMCCNo.1653的发酵培养基的自然起始pH值约为5-6;所述百分含量均为质量百分含量。发酵所述利迪链霉菌(6Yre/^o历7cesJyo^'c^)A01CGMCCNo.1653的条件可为在28。C的条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速振荡培养。发酵所述利迪链霉菌(5"^re/力o/z/cesJyA'cws)A02CGMCCNo.1654的发酵培养基的组成为每升培养基中含有由15g黄豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，10g蔗糖，10g淀粉，2.5g硫酸铵，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，lg碳酸钙，其余为水；所述利迪链霉菌(6Yrepfo历yces7j^2'cws)A02CGMCCNo.1654的发酵培养基的pH为7-8。其中，由15g黄豆粒得到的提取液按如下方法制备将15g黄豆粒加入蒸馏水中，煮沸0.5-lh，滤去固形物，得到由15g黄豆粒得到的提取液。发酵所述利迪链霉菌(5Yrepto/ff7cesJ/心ciAs)A02CGMCCNo.1654的条件具体可为在31"C的条件下，以13mra的旋转半径、240rpm的转速振荡培养。所述制备纳他霉素的方法还包括分离纯化纳他霉素的步骤。其中，分离纯化纳他霉素的步骤具体可为1)收集发酵所述利迪链霉菌(5Yre/^o/z/ces得到的发酵液，用无水乙醇进行沉淀，收集上清液；2)将所述上清液依次进行树脂吸附层析、硅胶吸附层析和高效液相色谱分离，得到纳他霉素。当所述利迪链霉菌(5Yrepfo/z7/ces7/力'c"s)为利迪链霉菌(5Yre/^o历yces7yo7cws)A01CGMCCNo.1653时，分离纯化方法具体如下所述树脂吸附层析采用D4006大孔树脂，洗脱条件是依次用1倍柱体积的去离子水、1.5倍柱体积的50%甲醇和2.5倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集流出量为3.5倍至4.5倍柱体积之间的洗脱液；所述百分含量为体积百分含量；所述硅胶吸附层析采用200300目硅胶，洗脱条件是用体积比为l:2:l的正丁醇、甲醇和水的混合液进行洗脱，收集流出量为0.33倍至0.6倍柱体积之间的洗脱液；所述高效液相色谱分离采用LC-9101型循环制备高效液相色谱仪和JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱，以体积比为7:3的甲醇和水的混合液为流动相，分离二次，收集第二次分离时保留时间为38.399min的洗脱峰。当所述利迪链霉菌(5Yre/^咖yces7j7/icws)为利迪链霉菌(6Yre/^咖ycesJ/力'c^)A02CGMCCNo.1654时，分离纯化方法具体如下所述树脂吸附层析采用X-5大孔树脂，洗脱条件是依次用2倍柱体积的去离子水、2倍柱体积的30%甲醇和2倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集流出量为4.8倍至5.6倍柱体积之间的洗脱液；所述百分含量为体积百分含量；所述硅胶吸附层析采用100200目硅胶，洗脱条件是用其体积比为8:1:1的乙醇、氨水和水的混合液进行洗脱，收集流出量为0.23倍至1.2倍柱体积之间的洗脱液；所述高效液相色谱分离采用LC-9101型循环制备高效液相色谱仪和JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱，以体积比为7:3的甲醇和水的混合液为流动相，分离三次，收集第三次分离时保留时间为39.766min的洗脱峰。本发明生产纳他霉素的方法，开创性地用利迪链霉菌发酵生产纳他霉素，从而为生产纳他霉素提供了新的途径。本发明方法分离纯化得到的纳他霉素纯度很高，达99%以上。因此，本发明将在高纯度纳他霉素的生产中得到广泛应用。图1A为利迪链霉菌(5Yr印t咖/ces77&'ci/s)A01CGMCCNo.1653无菌发酵滤液对酵母菌的抑制作用。图IB为利迪链霉菌(5Yr印"/z^ces7y力'c(/s)AOlCGMCCNo.1653无菌发酵滤液对灰葡萄孢的抑制作用。图2A为利迪链霉菌(5Yre;^咖ycesA02CGMCCNo.1654无菌发酵滤液对酵母菌的抑制作用。图2B为利迪链霉菌(5"^re/7fo/^ces"Wcm)A02CGMCCNo.1654无菌发酵滤液对灰葡萄孢的抑制作用。图3为利迪链霉菌(5"^re/Z^z^ces7yo7cws)AOlCGMCCNo.1653活性产物的捷克八溶剂系统纸层析结果。图4为利迪链霉菌(6Yre/^咖yces77力'cfAs)AOlCGMCCNo.1653活性物质粗提物的紫外吸收光谱图。图5A为利迪链霉菌(5Yrep"/z/cesJy&'ciAs)AOlCGMCCNo.1653活性产物的HPLC第一次分离谱图。图5B为利迪链霉菌(5Yr印fo/^cesAOlCGMCCNo.1653活性产物的HPLC第二次分离谱图。图6A为利迪链霉菌(5Yre;fo/^cesJya^'cws)A02CGMCCNo.1654活性产物的HPLC第一次分离谱图。图6B为利迪链霉菌(5Yre/^o/z^ces7y力'ciAs)A02CGMCCNo.1654活性产物的HPLC第三次分离谱图。图7A为利迪链霉菌(5Yre/^o/zyces^r力'c〃s)AOlCGMCCNo.1653活性产物纯样品的紫外扫描图谱。图7B为利迪链霉菌(5Yrepfo/z/ces7yo7cws)A02CGMCCNo.1654活性产物纯样品的紫外扫描图谱。图8A为利迪链霉菌(5Yre/^咖yces7yA'cw5)AOlCGMCCNo.1653活性产物纯样品的红外吸收光谱。图8B为利迪链霉菌(5Yre;^o/ff7cesJyWcM)A02CGMCCNo.1654活性产物纯样品的红外吸收光谱。图9A-a为利迪链霉菌(6Yre/JZ^yces7y力'ci/s)AOlCGMCCNo.1653活性产物纯样品的高分辨质谱图(负离子)。图9A-b为利迪链霉菌(5Yrepfo/_KcesJj&'cws)AOlCGMCCNo.1653活性产物纯样品的高分辨质谱图(正离子)。图9B-a为利迪链霉菌(5Yrept咖ycesA02CGMCCNo.1654活性产物纯样品的高分辨质谱图(负离子)。图9B-b为利迪链霉菌(5Yrept咖yces7y力'cz/s)A02CGMCCNo.1654活性产物纯样品的高分辨质谱图(正离子)。图IOA为利迪链霉菌(6Yr印z^z7cesAOlCGMCCNo.1653活性产物纯样品的核磁共振氢谱(500MHz)。图IOB为利迪链霉菌(&rep^MycesJyo^cws)A01CGMCCNo.1653活性产物纯样品的核磁共振碳谱(500MHz)。图IIA为利迪链霉菌(5Yr印"/H/ces7j^z'ct/s)A02CGMCCNo.1654活性产物纯样品的核磁共振氢谱(500MHz)。图IIB为利迪链霉菌(5"tre/^咖7cesJy&'cM)A02CGMCCNo.1654活性产物纯样品的核磁共振碳谱(500MHz)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例中所使用的培养基如下1、高氏一号培养基每升培养基中含有K2HP040.5g，NaCl0.5g，KN031.0g，FeS047H200.01g，MgS047H200.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，其余为水；所述高氏一号培养基的pH为7.2-7.4。2、利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653的种子培养基每升培养基中含有黄豆粉20g，蛋白胨5g，可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，玉米浆2.5g，(NH4)2S042.5g，K2HP040.02g，NaCl4g，CaC036g，其余为水；所述利迪链霉菌A01CGMCCNo.1653的种子培养基的pH为7.2。121。C灭菌30min。3、利迪链霉菌A01CGMCCNo.1653的发酵培养基每升培养基中含有黄豆粉2%，蛋白胨O.5%，可溶性淀粉O.5%，葡萄糖2%，玉米浆0.25%，(NH4)2S040.25%，MgS047H200.025%,K2HP040,002%，NaCl0.4%，CaC030.2%，其余为水；该发酵培养基的自然起始pH值为5.6。其中，各百分含量均为质量百分含量。4、利迪链霉菌(5Yrep^wyces7yo7cws)A02CGMCCNo.1654的种子培养基由15g黄豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，20g葡萄糖，10g淀粉，2.5g硫酸铵，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加lg碳酸l丐，加水定容至lOOOml。5、利迪链霉菌(5Yre;^M^cesJy&'c^)A02CGMCCNo.1654发酵培养基由15g黄豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，10g蔗糖，10g淀粉，2.5g硫酸铵，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加lg碳酸钙，加水定容至1000ml。其中，由15g黄豆粒得到的提取液按如下方法制备将15g黄豆粒加入适量蒸馏水中，煮沸0.5-lh，滤去固形物，得到由15g黄豆粒得到的提取液。6、PDA培养基每升培养基中含有马铃薯200g，蔗糖10—20g，琼脂17—20g，其余为水；pH自然。实施例l、利迪链霉菌(5Yr印z^M77ces7/Wc"s)A01CGMCCNo.1653的分离从北京密云县蔬菜田采集土样，取10g加入内装100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中，置摇床上100rpm振荡20min,取O.5ml加入4.5ml无菌水中，再依次稀释102、103、104倍，各取以上土壤悬液O.lml分别均匀涂布在高氏一号培养基平板上，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置28"C恒温箱中培养5-IO天，挑取放线菌单菌落进行稀释划线分离纯化，得到纯培养菌株。初筛获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵，发酵液经O.45pm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液；以酿酒酵母(&cc力aro/^cescerew'w'aeACCC20036)、黑曲霉"印ej^i"〃sd>erACCC30005)和灰葡萄孢(&t」ryd'sc&ereaACCC30091)为指示菌，利用管碟法或洋菜打孔法检测发酵液的抑菌活性；对初筛获得的有抑菌活性的菌株的无菌发酵滤液进行乙醇沉淀去除杂质，上清液进行紫外扫描获得紫外图谱，并与多烯类抗生素的图谱进行比较，筛选出具有多烯类典型吸收峰的紫外图谱的菌株；将复筛获得的菌株的无菌发酵滤液去除杂质浓縮后进行柱层析分离，并用指示菌跟踪检测各分离组分的活性，对主要活性组分进行制备型高效液相色谱分离得到其纯样品；检测鉴定该纯样品，最终筛选出能够产生纳他霉素的菌株——利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653。利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653的微生物学特性鉴定(1)菌体的形态特征革兰氏染色阳性；在GYM琼脂、JCM42"琼脂、燕麦粉琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝直、柔曲或弯曲，孢子椭圆形。(2)培养特性在6种固体培养基上的培养特性如表1所示。表1利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653的培养特性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(3)生理生化特性利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653的生理生化特性如表2所示。表2利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注"W"表示弱阳性结果；"+"表示阳性结果；"一"表示阴性结果。(4)16SrDNA序列利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653的部分16SrDNA序列如序列表中序列l所示。与GenBank中相关序列Blast比较的结果表明其属于链霉菌属；其16SrDNA序列与已知的利迪链霉菌菌株NRRL2433相比相似性很高，为100%。综合其形态学特征、培养特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的结果，将其鉴定为利迪链霉菌(5Yre/^o/^cesJ7^'cm)，并将此菌株定名为利迪链霉菌(5^repto历7cesJj^/iciAs)AOl。禾!j迪链霉菌(5Yre/^o历yces2j^z.ciAS)A01已于2006年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNo.1653。实施例2、利用利迪链霉菌摇瓶发酵生产纳他霉素利迪链霉菌AOlCGMCCNo.1653和A02CGMCCNo.1654在代谢过程中能够向培养基中产生大量的生物活性物质。该生物活性物质对指示菌株酿酒酵母ACCC20036、黑曲霉ACCC30005和灰葡萄孢ACCC30091具有强烈的抑制作用；其捷克八溶剂系统的纸层析图谱与多烯类抗生素的一致；其紫外光谱表现四烯类抗生素所特有的典型吸收峰，这与捷克八溶剂系统纸层析的结果相一致；对其进行初步分离后发现有2个活性组分，对主要活性组分纯化后进行紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)和核磁共振谱(丽R)检测分析，结果表明其分子量、分子式和化学结构均与纳他霉素相同。纳他霉素的具体生产和鉴定方法如下一、纳他霉素的制备1、利用利迪链霉菌(5Yre;^咖yces7y力'cws)AOlCGMCCNo.1653摇瓶发酵制备纳他霉素斜面培养将利迪链霉菌(5"^re/z^/z7/ces7y^'ciAs)AOlCGMCCNo.1653接种到高氏一号斜面培养基上，28。C培养7-10天至其产生足量的孢子；种子培养用无菌铂环刮取其孢子3—5环接种于装有100ml种子培养基的500ml三角瓶内，置可控温摇床上，在28。C条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速恒温振荡培养20-24h;发酵培养取上述种子培养液按3%(V/V)的接种量接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶内，在28。C条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速恒温振荡培养96h。此时菌株已在发酵液中产生高浓度的纳他霉素。发酵液经O.45pm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液，分别以酿酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091为指示菌，利用洋菜打孔法进行活性检测，发酵液的抑菌圈直径分别达31.Oran和43.0mra(图lA和图lB)。2、利迪链霉菌(5Yrept咖7ces7y力'c^)A02CGMCCNo.1654摇瓶发酵制备纳他霉素斜面培养将利迪链霉菌(5Yrepz^/z7ces^g7cm)A02CGMCCNo.1654接种到高氏一号斜面培养基上，28"培养7-10天至其产生足量的孢子；种子培养用无菌铂环刮取2—3环孢子接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶内，在28X:条件下，以13mm的旋转半径、200rpm的转速恒温振荡培养24h-30h;发酵培养在无菌条件下，将种子培养液以5y。(V/V)的接种量接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶内，在31。C条件下，以13mm的旋转半径、240rpm的转速恒温振荡培养96h。此时菌株已在发酵液中产生高浓度的纳他霉素。发酵液经O.45pm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液，按上述方法测定其抑菌活性，其对酿酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091的抑菌圈直径分别达32.0mm和47.0mm(图2A和图2B)。二、发酵液中纳他霉素的粗提和初步鉴定(一)发酵液中纳他霉素的粗提将上述利迪链霉菌(5Yre/^咖yces7yc/i'cws)A01CGMCCNo.1653和利迪链霉菌(5Yr印z^zyces7yo7c"s)A02CGMCCNo.1654的发酵液分别用3倍体积的无水乙醇预处理，4。C静置2h，以沉淀菌体、固形颗粒、可溶性粘胶状物、核酸和杂蛋白质以及中间代谢产物等，上清液用2层滤纸以布氏漏斗真空抽滤，滤液经旋转蒸发仪在45'C下减压浓縮，浓縮液即为活性物质粗提物，4r保存备用。(二)发酵液中纳他霉素的初步鉴定采用捷克八溶剂系统纸层析来鉴别活性物质的化学类型，同时在190mn400nm范围内对其进行全波长扫描。1、捷克八溶剂系统纸层析溶剂系统为I.水饱和的正丁醇；II.含2%(质量百分含量)对甲基苯磺酸的水饱和的正丁醇溶液；III.正丁醇醋酸水(体积比)=2:1:1;IV.含2%(质量百分含量)六氢吡啶的水饱和的正丁醇；V.正丁醇饱和的0.5mo1/1pH为7.0的磷酸缓冲液；VI.含2%(质量百分含量)对甲基苯磺酸的正丁醇饱和的水；W.苯甲醇(体积比)=4:1，滤纸用0.5mo1/1pH7.0的磷酸缓冲液处理；VID.甲醇3%(质量百分含量)NaCl水溶液(体积比)=3:1，滤纸用5%(质量百分含量)硫酸钠水溶液处理；采用新华一号滤纸，裁成长16XIcm的纸条；层析在20cmX3cm的试管中进行；具体操作步骤如下①每支试管中分别加入各溶剂系统展开剂4ml，用橡皮塞封口，让展开剂的蒸汽充满整个展层空间；②取上述纳他霉素粗提物样品，用微量移液器或毛细管在滤纸条的一端分多次点样，每次在自动干手器下边点边以热风吹干，上样量为15W，点样的直径以不超过5mm为宜；③待滤纸上的样品吸干后，先将其悬挂在试管内，用橡皮塞密闭管口，使滤纸在展开剂的蒸汽中平衡0.5h后，将其点样端浸于展开剂中上行展层，勿使溶剂与样品直接接触；待展开剂接近前沿时，取出滤纸条悬于通风橱中晾干或用热吹风使溶剂尽量挥发；④在无菌条件下用定制的方形玻璃盘制备PDA平板，取适量培养好的灰葡萄孢ACCC30091的孢子悬浮液均匀涂布在平板上；将层析后的滤纸条依次贴于平板上，室温静置约30min，使纸条上相应部位的活性物质渗透扩散到培养基中；用无菌小镊子取出纸条，并标记其在平板上的位置；将平板置25。C恒温培养箱培养48h进行生物学显影；⑤根据生物活性显示的结果，测量有效成分在不同pH下的展层距离，按下述公式计算迁移率Rf值，画出pH层析谱Rf二原点到抑菌圈中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。纸层析结果显示，2个菌株的活性物质的图谱基本一致，在溶剂II和溶剂VI中不显迹，溶剂W中不移动，即Rf值为O(图3)，这与多烯类抗生素在八溶剂系统中的纸层析图谱相近。这表明其产生的活性物质可能属于多烯类抗生素。其中在溶剂III中在点样量大时偶尔出现一大(Rf=0.333)—小(Rf=0.754)两个抑菌区域，表明该活性物质至少有两个活性组分。2、紫外扫描将步骤(一)获得的纳他霉素粗提物样品用去离子水稀释40倍，以去离子水做空白对照，采用日立UV-VIS3010紫外可见分光光度计在190nm400nm范围内进行全波长扫描。2个菌株粗提物的紫外吸收光谱中，虽然杂质峰较多，但在292nm、305nm和319nm处有明显的三个吸收峰(图4)，多次重复该试验发现样品的浓度越大吸收峰的峰值越高，表明活性物质的含量越高。这三个典型的吸收峰是多烯类中四烯类抗生素所特有的特征峰，这与捷克八溶剂系统纸层析的测定结果一致。据上述分析，初步确定2个菌株所产生的活性物质的有效组分属于四烯类抗生素。三、纳他霉素粗提物的分离纯化通过大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和高效液相色谱仪HPLC进行逐步分离纯化。1、大孔树脂吸附柱层析对于利迪链霉菌(5"^r印z^^cesJ/o7c^)A01CGMCCNo.1653，选用40cmX2.6cm玻璃层析柱，D4006大孔树脂(天津南开大学化工厂)，大孔树脂按厂家说明预处理后用适量去离子水调匀，缓慢加入装有l/3体积去离子水的层析柱中，同时从柱底部以匀速缓慢放出蒸馏水，使柱中液面始终保持在树脂层上面。装至约3/4柱高度，自然沉降610h，使平衡后的装柱体积为150ml。将纳他霉素粗提物与树脂按2:l的体积比进行动态吸附；吸附完毕后，关闭与柱所连的恒流泵，层析柱静置2h，然后依次用1倍柱体积的去离子水、1.5倍柱体积的50%(体积百分含量)甲醇和2.5倍柱体积的80%(体积百分含量)乙醇洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管15ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。结果表明活性洗脱液集中在第3545管(即自流出量为3.5倍柱体积至4.5倍柱体积之间的洗脱液)。对于利迪链霉菌(5"z^repto历7ces"dic〃s)A02CGMCCNo.1654，选用40cmX2.6cm玻璃层析柱，X-5大孔树脂(天津南开大学化工厂)。用上述同样的方法装柱。取纳他霉素粗提物与树脂按1:1的体积比进行动态吸附。洗脱过程为2倍柱体积的无离子水洗脱除去部分色素和大量水溶性杂质；2倍柱体积的30%(体积百分含量)甲醇洗脱去色素；最后用2倍柱体积的70%(体积百分含量)乙醇洗脱活性成分。分管收集洗脱液，每管15ml，滤纸片法进行活性测定。结果表明活性洗脱液集中在第4856管(即自4.8倍柱体积至5.6倍柱体积之间的洗脱液)。分别合并各菌株有活性的洗脱液，45°C下减压浓縮后供下一步分离。2、硅胶吸附柱层析对于利迪链霉菌(6Yr印z^/z/ces"o7c〃s)A01CGMCCNo.1653，选用40cmX2.6cm玻璃层析柱，200300目硅胶，以体积比为1:2:1的正丁醇、甲醇和水的混合液为洗脱液；取约150g硅胶用去离子水浸泡3h，倾去细小颗粒，布氏漏斗真空抽滤除去水分；再用6mol/LHCl浸泡12h，然后用去离子水洗至中性，真空抽干；用无水乙醇浸泡过夜，真空抽干；临用前在120。C下活化2h，干燥至恒重；层析柱中装入l/3柱体积的洗脱液，然后缓慢加入用洗脱液混合均匀的硅胶，约至3/4柱高时停止加入，静置610h，使硅胶缓慢沉降。然后用23倍体积的洗脱液以lmL/min的流速冲洗柱体，使之平衡。平衡后的柱体积为150ml。取步骤1的大孔树脂活性洗脱浓縮液10ml上柱进行动态吸附，用23倍柱体积的洗脱液按0.5ral/min的流速进行洗脱，用自动部分收集器分管收集洗脱液，每管5ml。以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。结果表明其洗脱液中的活性组分集中在第1018管(即自0.33倍柱体积至0.6倍柱体积之间的洗脱液)。对于利迪链霉菌(5Yrepfo/^ces7y力'c〃s)A02CGMCCNo.1654，选用40cmX2.6cm玻璃层析柱，100目200目硅胶，以体积比为8:1:1的乙醇、氨水和水的混合液为洗脱液；用同样的方法装柱、上样吸附、洗脱并进行活性检测。结果表明其洗脱液中的活性组分集中在第736管(即自0.23倍柱体积至1.2倍柱体积之间的洗脱液)。分别合并各菌株的活性洗脱液，45。C真空减压浓縮，浓缩液用于下一步分离。3、制备型HPLC分离纯化采用LC-9101型循环制备HPLC，JAIGEL-0DS-AP型SP-120-15制备柱。取步骤2的硅胶柱层析后的活性洗脱浓縮液，用0.45Wn微孔滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量6ml;以甲醇水(体积比为7:3)为流动相进行分离，利用UV检测器在波长305nin处检测并自动形成分离图谱；利用馏分收集器分别收集图谱中各曲线峰所对应的洗脱液；以酿酒酵母菌ACCC20036为指示菌，利用滤纸片琼脂扩散法检测每管洗脱液活性。对于菌株A01CGMCCNo.1653，以2ml/min的泵流速相继分离2次；对于菌株A02CGMCCNo.1654，以2ml/min的泵流速进行第一次分离后，再以3ml/min的泵流速相继分离2次。实验结果表明，菌株AOlCGMCCNo.1653的第一次HPLC分离共检测到6个峰，其中在保留时间为57.399min的峰为主要活性峰(图5A);对其进行的第二次分离检测到保留时间为38.399min的峰为活性峰(图5B)，其相对峰面积百分比为99.503%，表明样品纯度达99.503%以上。菌株A02CGMCCNo.1654的第一次HPLC分离共检测到30个峰，其中保留时间为57.866rain的强吸收峰为活性峰(图6A)，其相对峰面积为35.121%;对其进行的第二次分离检测到6个峰，其中保留时间为41.699min的峰为活性峰，其相对峰面积为97.020%;第三次分离检测到保留时间为39.766min的峰为活性峰(图6B),通过峰面积计算其纯度为99.845%。对2个菌株的最终样品分别进行真空浓縮，干燥后呈白色或奶油色粉末。利用岛津分析型HPLC分别采用下述两种方法对其进行纯度验证。1)取少量样品溶于70%甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为U反相柱，柱温30°C，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样1(^1，以lml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下时间(分)A(%)B(%)0103565112050502130653531408020415095551601000结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。2)取少量样品溶于70%甲醇水溶液，以乙腈(A)和水(B)为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为ds反相柱，柱温3(TC，UV检测器，检测波长305nm，SIL-10ADVP自动进样器进样10nl，以lml/min的流速洗脱60min。梯度洗脱步骤如下时间(分)A(%)B(%)0153565163050503145703046601000结果显示洗脱曲线为单一的峰，说明其为单一组分，纯度达到化学结构测定的要求。两种验证方法得到的结果一致。四、纯化样品化学结构的解析鉴定1、紫外吸收光谱(uv)将上述步骤三纯化的样品极微量溶于超纯水中，用日立UV—VIS3010紫外可见分光光度计在190nm400nm波长范围内以超纯水为空白对照进行全波长扫描，自动形成紫外吸收图谱。由紫外扫描图谱可见，2个菌株活性物质的紫外吸收峰均表现出典型的四烯类抗生素谱型，即在波长281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共轭四烯发色基团的吸收峰，其中波长305nm处吸收值最大，281nm处吸收值最小(图7A和7B)，再次验证了该活性物质属于多烯类中的四烯抗生素。2、红外吸收光谱(IR)采用KBr压片法，用德国BRUKER公司TENSOR27傅立叶红外光谱仪进行400cm—'-4000cm—'区域内扫描。菌株A01CGMCCNo.1653所生产的纳他霉素纯化样品的红外光谱如图8A所示，其中vMX3593、3493、3280cm—1为分子中N-H和-OH的伸縮振动特征吸收峰；v_3017、2978、2940cm—'为分子中-CH3和-CH2的伸縮振动特征吸收峰；vmax1716cm—1为OO的强吸收特征峰；vmax1634、1570cm—工为C^伸縮振动的特征吸收峰；另外，在vmax1401、1267、1190、1107、1060、1003、885、847、798cm—'等处都有吸收峰。菌株A02CGMCCNo.1654的纯化样品的红外光谱如图8B所示，其中vraax3416.78cm—'为-OH的特征吸收峰；vmax3288.23cm—'为N-H的伸縮振动特征吸收峰；vmax2940.44和2980.27cnf'是-CH3的特征吸收峰；vMX3017.23cm—'是-012的特征吸收峰；vmax1715.38cm—'表现典型的羰基强吸收峰；vmax1571.44cnf'表现-C《-的强吸收峰；v_163140cm—'表现-OC-的弱吸收峰。3、高分辨质谱采用德国BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四级杆傅立叶串联质谱仪(9.4TQ-FT-MS);条件capillary4000，DryGas:4.0l/s，源温180°C，scanrange:3002000，syringepump:1.5ml/min，数据分析软件为BrukerDaltonicsDataAnalysis3.4。结果表明，对AOlCGMCCNo.1653所生产的纳他霉素纯化样品进行分析的谱图中，正离子检测方式，检测到分子离子峰[M+Na]+为m/z:688.2938的化合物(图9A-b);负离子检测方式检测到分子离子峰[M-Hr为m/^664.2976的化合物(图9A-a)。对A02CGMCCNo.1654所生产的纳他霉素纯化样品进行分析的图谱中，采用正离子检测方式检测到加合离子[M+Na]+为m/z688.2937(图9B-b);采用负离子检测方式检测到准分子离子[M-H]+为m/z664.2975的化合物(图9B-a);采用正、负离子检测方式对A02拮抗产物纯品进行检测分析，确定664.2975为分子离子峰。综上所述，分析确定2个菌株所产生的活性物质的主要活性组分的分子式均为C33H47N013，分子量为665;由公式不饱和度(n)=1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc:碳原子数；Nn:氮原子数；Nh:氢原子数)计算其分子式的不饱和度为11，表明其分子结构中含有多个不饱和键与环等。4、核磁共振谱(NMR)以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，以四甲基硅烷(TMS)为内标，室温下测定。采用BrukerAVANCEDRX-500核磁共振谱仪(德国Bruker光谱仪器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)为溶剂，四甲基硅垸(TMS)为内标，进行氢谱CHNMR)和碳谱(13CNMR)的测定；前者共振频率为500.1325156MHz，采样次数32768次；后者共振频率125.7577612MHZ，采样次数为65536次。实验结果表明，在A01CGMCCNo.1653所产生的活性产物纯样品的'H-NMR图谱(图10A)中，由于采用DMF做溶剂，使得羧基上的氢被中和，5=12的峰消失，同时增加了5=3和8的两处溶剂峰，5=6附近的一组峰代表了共轭多烯上的氢，5=5左右的一组峰则代表羟基；"C-丽R图谱(图10B)中，强度最大的峰系由溶剂DMF产生，S=180和165的峰表明分子中羧基和酯基的存在，S=130左右的一组峰则由共轭多烯产生；当6=135'时，DEPT谱图中CH和CH3峰的谱线朝上，C仏峰的谱线朝下，分子中共有5个-CH2。从A02CGMCCNo.l654所产生的活性产物纯样品的核磁共振"C图谱(图11B)中可以看出，分子中有一个羧基碳原子的化学位移(S165.217);—个羰基碳原子的化学位移(S178.603);—组共轭四烯碳原子的化学位移(S125.089145.447);—组与羟基相连的碳原子的化学位移(566.10270.326);糖环上五个碳原子共振峰(S71.19497.894);甲基碳原子共振峰(S18.062，S20.360)。500兆赫的核磁共振^图谱(图11A)中可以看出，多烯环上和四个双键相连的质子氢(-CH-CH-)的化学位移(S5.6866.625ppm);五个羟基中的质子氢的化学位移值(S4.1874.741ppm);五个亚甲基和两个甲基中的质子氢的化学位移(S1.2742.439ppm)。综合分析上述实验数据，判定这两个菌株所产生的活性产物的主要活性组分为纳他霉素，其化学结构式为序列表<160〉1<210>1<211>1270〈212〉DNA〈213〉利迪链霉菌(5Yr一o季esJWc〃s)〈400〉1gggtctaataCCgg3t3Cg3cacggggtcgcatgacctccgtgtggaaagctccggcggt60gg3tgsgcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacga120cgggtagccggcctggggcgaccggcc3cactggga_ctgcacggcccagactcc180tacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcg3gcctgatgcagcgscgccg240cgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcggtga300cggtacctgcagaaggcgccggctaactacgtgccagc3gCCgCggt3atacgtaggg360cgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcgga420tgtagcccggggcttsaccccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggt■aggggtcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgg540tggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcg600C3ggsttag3taccctggtagtccacgccgtacgttgggaactaggtgtgggcgacat660tccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgca720aggctactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaM780tcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcccggaaaaccctggag3ca_g840ggtcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgaga■tgttgggttaagtcccgcaaCgElgCgCCccttgttctgtgttgccagcatgcccttcg960gggtgatggggactcacaggctgccggggtcaactcggaggggtggggacgacgt1020caagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatga1080gctgcgataccgcgtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtc1140tgcaactcgacccc￡itga_a_gtcggagttgctagtaatcgctgctgcggtg1200aatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacg犯agtcggtascacccga1260agccggtggc1270权利要求1、一种制备纳他霉素的方法，是发酵利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)得到纳他霉素。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利迪链霉菌(&re/^o/^ces^ro7cM)为利迪链霉菌(5Yr印fcMyces77力'cws)A01CGMCCNo.1653或利迪链霉菌(Stre/^0/z77ces2yo^.cws)A02CGMCCNo.1654。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于发酵所述利迪链霉菌(5Yre/^o/Byces7yWcM)A01CGMCCNo.1653的发酵培养基的组成为每升培养基中含有黄豆粉2%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉0.5%，葡萄糖2%,玉米浆O.25%，(NH4)2S040.25%，MgS04.7H200.025%，K2HP040.002%，NaCl0.4%，CaC030.2%，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量。4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于发酵所述利迪链霉菌(5Yrepz^z^cesJj^/cws)A01CGMCCNo.1653的条件为在28。C的条件下，以13mm的旋转半径、180rpm的转速振荡培养。5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于发酵所述利迪链霉菌(5Yrepz^7yces7yo7cws)A02CGMCCNo.1654的发酵培养基的组成为每升培养基中含有由15g黄豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，10g蔗糖，10g淀粉，2.5g硫酸铵，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，lg碳酸钙，其余为水；所述利迪链霉菌(6Yre/7力朋7cesA02CGMCCNo.1654的发酵培养基的pH为7-8。6、根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于发酵所述利迪链霉菌(5^印t卿yces^o7c〃s)A02CGMCCNo.1654的条件为在31。C的条件下，以13鹏的旋转半径、240rpm的转速振荡培养。7、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中还包括分离纯化纳他霉素的步骤。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述分离纯化步骤包括1)收集发酵所述利迪链霉菌(5Yrep^/^ces7/A'cM)得到的发酵液，用无水乙醇进行沉淀，收集上清液；2)将所述上清液依次进行树脂吸附层析、硅胶吸附层析和高效液相色谱分离，得到纳他霉素。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述利迪链霉菌(5Yrep"/^ces7y力'c〃s)为利迪f连霉菌(5Yrepz^/^ces7y&'c〃s)A01CGMCCNo.1653;所述树脂吸附层析采用D4006大孔树脂，洗脱条件是依次用1倍柱体积的去离子水、1.5倍柱体积的50%甲醇和2.5倍柱体积的80%乙醇洗脱，收集流出量为3.5倍柱体积至4.5倍柱体积之间的洗脱液；所述百分含量为体积百分含量；所述硅胶吸附层析采用200300目硅胶，洗脱条件是用体积比为l:2:l的正丁醇、甲醇和水的混合液进行洗脱，收集流出量为0.33倍至0.6倍柱体积之间的洗脱液；所述高效液相色谱分离采用循环制备型高效液相色谱仪及JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱，以体积比为7:3的甲醇和水的混合液为流动相，分离二次，收集第二次分离时保留时间为38.399min的洗脱峰。10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述利迪链霉菌(&r印^/^c"7y力'c〃s)为利迪链霉菌(6Yr印foyz^ces7y力'c〃s)A02CGMCCNo.1654;所述树脂吸附层析采用X-5大孔树脂，洗脱条件是依次用2倍柱体积的去离子水、2倍柱体积的30%甲醇和2倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集流出量为4.8倍至5.6倍柱体积之间的洗脱液；所述百分含量为体积百分含量；所述硅胶吸附层析采用100200目硅胶，洗脱条件是用体积比为8:1:1的乙醇、氨水和水的混合液进行洗脱，收集流出量为0.23倍至1.2倍柱体积之间的洗脱液；所述高效液相色谱分离采用循环制备型高效液相色谱仪及JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制备柱，以体积比为7:3的甲醇和水的混合液为流动相，分离三次，收集第三次分离时保留时间为39.766min的洗脱峰。全文摘要本发明涉及一种制备纳他霉素的方法。本发明所提供的制备纳他霉素的方法是发酵利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)得到纳他霉素。本发明生产纳他霉素的方法，开创性地用利迪链霉菌发酵生产纳他霉素，从而为生产纳他霉素提供了新的途径。本发明方法生产的纳他霉素的纯度高。本发明将在高纯度纳他霉素的生产中得到广泛应用。文档编号C12P19/08GK101397579SQ20071018743公开日2009年4月1日申请日期2007年11月23日优先权日2007年9月29日发明者霆刘,刘伟成,刘建华,刘德文,卢彩鸽,裘季燕,勤隋申请人:北京市农林科学院
文档序号 :
【 436246 】
技术研发人员：刘伟成、裘季燕、刘建华、卢彩鸽、刘霆、刘德文、隋勤
技术所有人：北京市农林科学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：刘伟成、裘季燕、刘建华、卢彩鸽、刘霆、刘德文、隋勤
技术所有人：北京市农林科学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除