制备叶绿素a和二氢卟酚e6的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备叶绿素a和二氢卟酚e6的方法。
背景技术：
二氢卟酚e6是一种用于癌症光动力治疗的光敏材料。 美国专利No. 5， 330， 741公开了制备二氢卟酚e6的方法。按照美国专利 No. 5，330，741的方法，用丙酮处理生物材料2 3次以提取叶绿素a，过滤 或离心生物材料，蒸干提取物，用酸处理以除去叶绿素分子中的镁离子并水 解叶绿基酯基团。加入甲醇以协同进行酯化作用，用水处理该反应物质，脱 镁叶绿酸a衍生物用亚甲基亚氯酸(chlorous methylene)抽提，将该提取物 中和、用水洗涤、蒸干、用氧化铝色谱分离。脱镁叶绿酸a甲酯从亚甲基亚 氯酸-甲醇的混合物中结晶出来，且使产生的脱镁叶绿酸a衍生物在有氧条 件下在吡啶-二乙醚-正丙醇中与强无机碱反应，反应物质用水处理。将水相 酸化至pH4，不稳定的二氢卟酚用亚甲基亚氯酸抽提，将提取物蒸干，不稳 定的二氢卟酚再溶解于四氢呋喃，蒸干溶液，重复本步骤直至在700nm的吸 收值停止升高，得到的红紫素18溶解于四氢呋喃，用重氮甲垸酯化，使红紫 素18甲酯在吡啶存在下在亚甲基亚氯酸中与赖氨酸水溶液混合，混合物在室 温下搅拌12小时。在高真空下除去溶剂，然后获得的粗制品用反相高效液相 色谱(HPLC)提纯，冷冻干燥除去溶剂。PS溶解于磷酸盐缓冲液以便得到用于 PDT的注射溶液，加入O. 1NNa0H溶液，用0. 1NHC1调节pH至生理值pH7. 35， 且该溶液经由微孔滤器过滤。
但是，这个方法的缺点是:低重现性、流程复杂(利用高真空、结晶、柱 色谱法和HPLC，并且与赖氨酸的长时间反应)、使用高毒性易燃试剂(重氮甲 烷、吡啶、甲醇、四氢呋喃、二乙醚)。这些缺点使该方法不适合用于药品和 食品工业。
按照韩国专利申请公开No. 2004-0025911，用丙酮处理螺旋藻属生物材 料直至叶绿素a被完全抽提，滤出或离心生物材料，提取物用酸处理以从叶 绿素分子中除去镁离子，中和该提取物，并滤出沉淀的脱镁叶绿素a，然后 在盐酸-丙酮-己烷混合物中水解脱镁叶绿素a，每lg粗制脱镁叶绿素a使用6 16ml丙酮、0. 6 6ml己烷和5 10ml浓盐酸。加热该混合物至40 60°C， 搅拌20分钟 1小时，然后加入己烷(6 16ml)，并且有机相用丙酮和盐酸 (2 10:1)的混合物洗涤，水相用己烷洗涤，滤出沉淀的脱镁叶绿酸a，用水 洗涤，再从丙酮-水混合物中结晶析出，风干至重量恒定。然后将脱镁叶绿酸 a溶解于丙酮，加入O. 05 1.0Cm浓度的强无机碱水溶液，在30 6(TC搅拌5 30分钟，再加入1 50%浓度的额外体积的强无机碱水溶液，在40 6(TC加 热混合物20 90分钟，用稀盐酸中和，离心分离二氢卟酚e6沉淀物，用蒸 馏水洗涤至酸性反应停止，即可获得55 80%的二氢卟酚e6。
该方法也有一些如步骤复杂以及使用的试剂不适合用于食品和药品领域 的缺点。
贯穿本申请，参考了一些专利和出版物，括号中提供引用出处。为了更充 分地描述本发明和本发明所属技术领域的状况，将这些专利和出版物公开的 内容纳入本申请。
发明内容
本发明人进行了深入的研究开发一种从属于绿藻类的小球藻中制备二氢 卟酚e6的高产方法，该方法相对简单并能大量生产。结果，发明人发现了通 过小球藻独特的预处理步骤制备二氢卟酚e6的高效方案。
因此，本发明的一个目的是提供一种制备叶绿素a的方法。
本发明的另一个目的是提供一种制备二氢卟酚e6的方法。
结合所附权利要求书和附图，从后续的详细描述中，本发明的其它目的 和优点将变得明显。
本发明的一个方面提供一种制备叶绿素a的方法，包括用有机溶剂处理 未破碎的完整小球藻的步骤。
为了有效制备二氢卟酚e6，本发明人首先打算开发一种有效制备二氢卟 酚e6的方法，并选取适合的小球藻作为原材料以达到这个目的。
按照本领域技术人员已知的常规方法，小球藻细胞首先被裂解，并使用 该细胞裂解液抽提叶绿素a。但是，不同于常规方法和手段，本发明人成功 地用未破碎的完整小球藻细胞以更高的产率制备二氢卧酚e6。考虑到常规方 法，本方法能够成功抽提叶绿素a的结果令人十分惊讶和意外。
在此使用的术语"完整小球藻"指未破碎的小球藻，与本领域技术人员 普遍使用的"活小球藻"具有相同的意思。在通常提取和分离细胞内物质时，会不可避免地伴随使用细胞破裂步骤(例如，超声破碎)。但是，在本发明中 使用未破碎的小球藻细胞本身。
本发明使用未破碎的小球藻细胞有似乎可能(plausible)的优点极好 的叶绿素a提取效率并避免了在细胞破裂步骤中引起的叶绿素a氧化作用。
本方法中可以使用的有机溶剂包括本领域技术人员熟知的各种有机溶 齐U，例如可使用(i)无水或含水的含l 4个碳原子的低级醇(甲醇、乙醇、丙 醇、丁醇等等)，(ii)低级醇和水的混合物，(iii)丙酮，(iv)乙酸乙酯，(v) 氯仿，(vi)醋酸丁酯，(vii)l，3-丁二醇，(viii)核酸和(ix)二乙醚。优选地， 在本发明中使用的有机溶剂是甲醇或乙醇，更优选乙醇。
在本发明中使用的小球藻可以是所有普通的小球藻，优选地，是海水小 球藻。更优选地，在本发明中使用的小球藻是椭圆小球藻(C力7ore7h e77i/ 5"c^'ofes) 、 }敛d、/j、 3E求藻 (6T JoreJZ3 /Z7i/7〃ti5"57'/ag )、 普通7j、 I求藻
C/Jore72s 5^1^msz^/ / ara、普通小球藻(C力7oreJJs raJgarj's)或蛋白核小5求 藻(OJoreWs Arre/7^Voss)，且最优选椭圆小球藻。
本发明另一个方面提供一种制备叶绿素a的方法，包括步骤(a)用30
8oy。的乙醇处理小球藻以从小球藻中除去除了叶绿素a以外的组分；禾n(b)用
90 100%的乙醇处理小球藻以提取叶绿素a，由此获得叶绿素a提取物。
本发明的另一个方面还提供一种制备叶绿素a的方法，包括步骤(a) 用80 100。/。的乙醇处理小球藻以提取叶绿素a;和(b)用二噁烷处理该提取物 以促使叶绿素a沉淀。
本发明人进行了深入研究开发出了一种从小球藻中高效制备叶绿素a的 方法，而叶绿素a是二氢卟酚e6的前体。因此本发明人发现了两套能够高产 率和高纯度制备叶绿素a的方案。
叶绿素a-方案A
叶绿素a-方案A包括用相对低浓度的乙醇从小球藻中除去除了叶绿素a 以外的组分的步骤和用相对高浓度的乙醇提取叶绿素a的步骤。
按照一种优选方案，在本发明中使用的小球藻是未破碎的小球藻细胞。 在本发明中，优选使用小球藻细胞本身，即通过声波处理的未破碎的细胞。 通常情况下用有机溶剂处理细胞裂解液提取叶绿素a。但是，按照一种优选 方案，使用未破碎的小球藻细胞本身。本发明使用未破碎的小球藻细胞有似乎可能的优点极好的叶绿素a提取效率并避免了在细胞破裂步骤中引起的 叶绿素a氧化作用。
按照一种优选方案，在本发明中使用的小球藻是海水小球藻，更优选椭
圆小球藻、微小小球藻、普通小球藻、/kscs、 67 A reJ7s zo/jV7gie脂's、 GW。reJJa 5"",t邵力ora、普通小球藻或蛋白核小球藻，且 最优选椭圆小球藻。
本发明的显著特征之一是在从小球藻中提取叶绿素a之前对小球藻实行 从小球藻中除去除了叶绿素a以外的组分的预处理步骤。这些预处理能使叶 绿素a被高纯度(含量百分比)地抽提出来。
其它组分的除去步骤是通过用30 80%的乙醇处理小球藻而实施的。使 用乙醇的理由是(i)乙醇在除去其它组分时表现出最高的效率，和(ii)在最 终产品二氢卟酚e6用作食品原料时，对人类无害的乙醇被优选应用。在这些 步骤中使用的乙醇浓度是30 80%。如果使用的乙醇浓度小于30%，则其它组 分的除去效率会变得很低；如果乙醇浓度超过80%，则叶绿素a的提取效率 将锐减，因为叶绿素a与其它组分一起被除去了。
优选地，在步骤(a)中的乙醇浓度是30 68。/。，较优选为50 65%，还更 优选为58 62%，最优选为大约60%。
步骤(a)进行至少一次，优选2 7次，更优选3 6次，最优选5 6次。 在步骤(a)重复实施时，通过在乙醇中悬浮小球藻细胞然后离心收集沉淀来除 去小球藻中的其它组分。
向除去其它组分的预处理后的小球藻细胞中，加入90 100%的乙醇以提 取叶绿素a。这时，乙醇浓度小于90%会使提取效率大大降低。
优选地，在步骤(b)中的乙醇浓度为95 100%，更优选为98 100%，最 优选为大约100%。
通过方案A的方法的叶绿素a的收率是5 15%，优选为6 12%，更优选 为7 9%。收率计算为获得的叶绿素a的重量占干重为lg的所用的小球藻的 百分比。
通过方案A的方法的叶绿素a的纯度范围为70 90%，优选70 85%，更 优选72 80%。
叶绿素a-方案B叶绿素a-方案B是使用高浓度的乙醇和二噁烷的方法，依据该方案，因 为在上述方案A中除去其它组分的步骤被省略，可通过简单步骤获得高产率
的叶绿素a。
在叶绿素a-方案B中使用的小球藻的详细情况与上述方案A相同。 叶绿素a-方案B的第一步是使用80 100Q/。的乙醇从小球藻中提取叶绿素
a的步骤。这时，乙醇浓度小于80%会使提取效率大大降低。
优选地，在步骤(a)中的乙醇浓度为90 100%，更优选为98 100%，最
优选大约100%。
叶绿素a-方案B的第二步是使用二噁垸沉淀叶绿素a的步骤。在这步中， 高纯度固相叶绿素a可通过沉淀法获得。1L叶绿素a提取物中使用的二噁烷 的量优选为50 250ml，更优选100 200ml，且最优选120 160ml ，但并不 局限于此。在这种情况下，使用的二噁烷为100%。
按照一种优选方案，该步骤是在加入二噁垸后加水到提取物中。1L叶绿 素a提取物中加入的水量优选为50 250ml，更优选100 200ml，且最优选 120 160nil，但并不局限于此。
按照一种优选方案，该方法进一步包括在步骤(b)后在低于-l(TC下冷却 步骤(b)的产物以促使叶绿素a更好沉淀的步骤。更优选地，温度范围为 -15°C -30°C，最优选从-18°C -25°C。
通过方案B的方法的叶绿素a的收率为3 15%，优选为4 10%，更优选 为4 6%。叶绿素a的纯度为70 98%，优选为75 95，更优选为80 90%。
本发明的另一个方面提供一种制备二氢卟酚e6的方法，包括步骤(a) 将用上述方法获得的叶绿素a用酸处理以从叶绿素a中除去Mg2+，藉此获得 脱镁叶绿素a;和(b)用碱处理该脱镁叶绿素a以获得二氢卟酚e6。
本发明人进行了深入的研究开发出一种从属于绿藻类的小球藻中高收率 制备二氢卟酚e6的方法，该方法相对简单并能用于大量生产。因此，本发明 人发现了制备二氢卟酚e6的高效方案。
本发明的制备二氢叶酚e6的方法是使用叶绿素a制备二氢卟酚e6的步 骤，而该叶绿素a是通过使用所述的制备叶绿素a的两个方法来获得的。
更具体地说，在使用通过叶绿素a-方案A制备的叶绿素a作为原材料的 情况下，本发明包括步骤(a)用30 68%的乙醇处理小球藻以除去小球藻中 的除了叶绿素a以外的组分；(b)用80 100%的乙醇处理小球藻以提取叶绿素a，藉此获得叶绿素a提取物；(c)用酸处理该叶绿素a以从叶绿素a中除 去Mg2+，从而获得脱镁叶绿素a;禾n(d)用碱处理该脱镁叶绿素a以获得二氢 口卜酚e6。更具体地说，在使用通过叶绿素a-方案B制备的叶绿素a作为原材料的 情况下，本发明包括步骤(a)用80 100%的乙醇处理小球藻以提取叶绿素a; (b)向该提取物中加入二噁烷以促使叶绿素a沉淀；(c)用酸处理叶绿素a以 除去叶绿素a中的Mg2+，从而获得脱镁叶绿素a;禾B(d)用碱处理脱镁叶绿素 a以获得二氢卟酚e6。同时，该制备二氢卟酚e6的方法包括使用酸制备脱镁叶绿素a的步骤和 使用碱制备二氢卟酚e6的步骤，更具体地说可以被分为两种典型方案。二氢卟酚e6-方案A二氢卟酚e6-方案A的实施是在乙醇溶剂存在下从脱镁叶绿素a制备二 氢叶酚e6。按照二氢卟酚e6-方案A，该方法用酸处理叶绿素a以除去叶绿素a中的 Mg2+，从而获得脱镁叶绿素a。叶绿素a和脱镁叶绿素a通过以下分子式1和 2表TK。当用酸处理叶绿素a时，M,从分子式1中除去，导致产生脱镁叶绿素a。 优选步骤(a)为通过用酸处理叶绿素a提取物以便使叶绿素a提取物的pH调 整至1 5。这时，pH高于5会使Mg2+的提取效率大大降低。更优选地，在步 骤(a)中反应体系的pH为1 3，最优选2 3。在步骤(a)中使用的酸可以为本领域技术人员熟知的各种酸，优选所述酸 为无机酸，更优选硫酸和盐酸，且最优选盐酸。以下分子式3所表示的二氢卟酚e6为通过用碱处理上述步骤制备的脱镁 叶绿素a制得的终产物。<formula>formula see original document page 11</formula>(3)按照一种优选方案，步骤(b)是用碱溶液处理脱镁叶绿素a，从而调整至 pH 11 16，更优选pH 13 14。在步骤(b)中使用的碱可以为本领域技术人 员所熟知的各种碱，优选为无机碱，且最优选NaOH。按照一种优选方案，制得二氢卟酚e6的步骤(b)是在乙醇溶剂存在下进 行的。按照一种优选方案，通过冷藏保存促使脱镁叶绿素a沉淀。 脱镁叶绿素a通常以沉淀物的形式获得。当使用乙醇溶剂制备二氢卟酚 e6时，脱镁叶绿素a的沉淀物不直接溶解于乙醇溶剂。因此，在乙醇溶剂中 溶解脱镁叶绿素a沉淀之前，优选用丙酮溶解脱镁叶绿素a沉淀。然后，从 溶解产物的丙酮中除去丙酮(例如通过蒸发)并向脱镁叶绿素a中加入乙醇 以溶解脱镁叶绿素a，接着使该溶解的脱镁叶绿素a与碱反应以获得二氢卟 酚e6。按照一种优选方案，二氢卟酚e6-方案A包括步骤(a)用酸处理通过上 述方法获得的叶绿素a以除去叶绿素a中的Mg2+，从而获得脱镁叶绿素a沉 淀；(b-l)向该脱镁叶绿素a沉淀中加入丙酮以获得脱镁叶绿素a溶液，然后 除去丙酮溶剂；(b-2)向残留的脱镁叶绿素a中加入乙醇以获得脱镁叶绿素a 溶液；和(b_3)用碱处理该脱镁叶绿素a溶液以获得二氢卟酚e6。按照一种优选方案，该方法进一步包括在步骤(b)后中和步骤(b)的产物 的步骤。这时，该产物可用各种碱中和(例如，HC1)。在生成二氢卟酚e6之后，可用盐处理二氢卟酚e6以具有适合的盐形式。 例如，通过用NaHC03或朋40)3处理二氢卟酚e6，使二氢卟酚e6的-C00H基与 钠或铵结合，从而获得二氢卟酚e6盐。由二氢卟酚e6-方案A获得的二氢卟酚e6的纯度为80 99%，优选85 99%，更优选93 98%。在使用小球藻作为原材料时，二氢卟酚e6的收率范 围为3 10%，优选3 8%，更优选4 6%。收率计算为获得的二氢卟酚e6 重量占干重为lg的所用小球藻的百分比。二氢卟酚e6-方案B二氢卟酚e6-方案B在丙酮溶剂存在下从脱镁叶绿素a中制备二氢卟酚e6。在二氢卟酚e6-方案B中步骤(a)的细节与上述的二氢卟酚e6-方案A相 同。此外，在二氢卟酚e6-方案B中的步骤(b)除了是在有丙酮溶剂存在下用 碱处理脱镁叶绿素a以外，与二氢卟酚e6-方案A相同。按照二氢卟酚e6-方案B，在步骤(a)中形成的脱镁叶绿素a沉淀溶解于丙 酮溶剂，而该脱镁叶绿素a溶液直接用碱处理，从而制备二氢卟酚e6。按照一种优选方案，二氢卟酚e6-方案B包括步骤(a)用酸处理通过上 述方法获得的叶绿素a以除去叶绿素a中的Mg2+，从而获得脱镁叶绿素a沉 淀；(b-l)向该脱镁叶绿素a沉淀中加入丙酮溶剂以获得脱镁叶绿素a溶液； 和(b-2)用碱处理该脱镁叶绿素a溶液以获得二氢卟酚e6。按照二氢卟酚e6-方案B，在使用NaOH作为碱的情况下，最终制得的二 氢卟酚e6具有钠盐形式。按照二氢卟酚e6-方案A，为了获得二氢卟酚e6 盐，必须进行单独处理，但方案B可以省略该步骤。二氢卟酚e6-方案B通过简单的步骤制备二氢卟酚e6，相对方案A是更 为有效的方法。此外，尽管二氢卟酚e6-方案B由比方案A更简单的步骤组 成，但最后制备的二氢卟酚e6的纯度比方案A的高很多。通过二氢卟酚e6-方案B制得的二氢卟酚e6的纯度为90 99. 99%，优选 92 99. 95%,更优选95 99. 90%，且最优选99. 0 99. 90%。在使用小球藻作 为原材料的情况下，二氢叶酚e6的收率为2 8%，优选3 8%，且更优选3 5%。本发明的特征和优点归纳如下(i) 本发明通过使用未破碎的小球藻细胞本身提取叶绿素a，从而从该叶 绿素a提取物中制备二氢卟酚e6。(ii) 在本发明中通过对选取的小球藻细胞本身进行预处理步骤可获得高 含量的叶绿素a。(iii) 本方法按照相对简单的步骤进行，并且适合二氢卟酚e6的大规模 生产。
图la lc为显示使用破碎的小球藻制得的叶绿素a的乙醇提取结果的 HPLC(高压液相色谱法)色谱图。图la lc分别显示提取30分钟、90分钟和 3小时的结果。箭头处表示叶绿素a峰。图ld lf为显示使用未破碎的完整小球藻制得的叶绿素a的乙醇提取结 果的HPLC色谱图。图ld lf分别显示提取30分钟、90分钟和3小时的结 果。箭头处表示叶绿素a峰。图2a为分析包含在未破碎的完整小球藻中的组分的HPLC色谱图。箭头 处表示叶绿素a峰。图2b 2g表示通过用60。/。的乙醇洗涤小球藻去除除了叶绿素a以外的组 分的HPLC分析结果。图2b 2g显示用60%的乙醇进行1 6次重复洗涤步骤 的结果分析。HPLC分析是针对洗漆产生的上清液的结果。图2h显示用100%的乙醇提取叶绿素a的HPLC分析结果。箭头处表示叶 绿素a峰。图2i显示按照使用二噁烷制备叶绿素a的方法制备的叶绿素a的HPLC 色谱图。箭头处表示叶绿素a峰。图3a显示按照本方法生成的脱镁叶绿素a的HPLC色谱图。箭头处表示 脱镁叶绿素a峰。图3b显示按照本方法方案A制备的二氢卟酚e6的HPLC色谱图。箭头处 表示二氢叶酚e6峰。图3c显示按照本方法方案B制备的二氢卟酚e6的HPLC色谱图。箭头处 表示二氢叶酚e6峰。现将通过实施例进一步描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是， 这些实施例用来更加具体说明，而如所附权利要求书中显示的本发明的范围 不局限于或不受限于这些实施例。实施例实施例l:适合的小球藻的选择准备用超声处理破裂的小球藻和用超声处理但未破碎的完整小球藻[海 水小球藻和椭圆小球藻，Chlorland co， Ltd]两种样本作为最后制得二氢卟 酚e6的原材料。然后，分析用超声处理破裂的小球藻和完整小球藻的叶绿素 a及其他组分的含量。将100ml乙醇分别加进10g用超声处理破裂的小球藻 和海水小球藻中，接着搅拌30分钟、90分钟、3小时和12小时，从而过滤 获得提取溶液。使用HPLC(高压液相色谱法)分析提取溶液，并且HPLC使用 具有SPD-M10AVP柱的HPLC系统(Dong-il Shimadzu Corp.)进行。进样体 积设为20n 1且流速为lml/分钟。Fluka提供的商品化的叶绿素a作为标准。 在图la lf中，观察到叶绿素a峰的大概保留时间在19. 5分钟。如图la lf所示，在使用完整小球藻的情况下，可获得的叶绿素a会比 使用超声破碎的小球藻多大约20倍。因此，我们发现由于具有更高的叶绿素 a收率，使用完整小球藻可以比使用超声破碎的小球藻获更大量的二氢卟酚 e6。有趣的是，我们发现使用完整小球藻自身的乙醇提取显示出比使用超声 破碎的小球藻的乙醇提取更加优异的叶绿素a提取率。鉴于此，本发明的方 法十分重要，因为它具有似乎可能的优点:极好的叶绿素a提取效率并且避免 了在超声破碎步骤中引起的叶绿素a氧化作用。实施例2:从叶绿素a中制备二氢卟酚e6方案^fi: AV、承嚴0餘去餘7^绿.素S以^游真g资分首先，为了除去从Chlorland co, Ltd购买的海水小球藻(椭圆小球藻) 中的盐份，用蒸馏水洗涤小球藻后在5000rpm下离心收集沉淀。沉淀物再用 蒸馏水悬浮并再次离心。用蒸馏水洗涤五次之后取出少量，使用HPLC(高压 液相色谱法)分析叶绿素a和其他组分的含量。HPLC是在具有SPD-M10AVP柱 的HPLC系统(Dong-il Shimadzu Corp.)上进行的，且进样体积设为20 n 1 ， 流速为lml/分钟。购自于Fluka的商品化的叶绿素a作为标准。HPLC结果示 于图2a中。如图2a所示，观察到叶绿素a峰的保留时间大约在9.7分钟，而其它组 分峰的保留时间在2. 5 7. 5分钟。100g除去海水的小球藻(非裂解的完整小球藻细胞)用300ml 60%的乙醇 洗涤，然后5000rpm离心收集沉淀，从而除去保留时间在2. 5 7. 5分钟的其 它组分。这些使用乙醇洗涤的步骤共进行六次。图2b 2g为乙醇洗涤中离心 产生的上清液的HPLC结果。如图2b 2g所示，可看到保留时间为2. 5 7. 5分钟的其它组分被60% 的乙醇的洗涤步骤大量除去。同时，在洗涤步骤使用的乙醇浓度超过80%的情况下，叶绿素a会被抽 提出来并且其它组分不能除去。此外，在洗涤步骤使用浓度为20%、 40%和50% 的乙醇溶液的情况下，与使用60%的乙醇相比，除去其它组分的效果都不好。因此，这些结果表明60%的乙醇为最优选的洗涤液。即60%的乙醇作为洗 涤液有效地从小球藻细胞中抽提了除了叶绿素a以外的组分，导致了在洗涤 后的小球藻细胞中具有比较高的叶绿素a含量。^ U餘去某g邀分游V、朝麥屮碧欲/^绿f a在向lOOg除去其它组分的小球藻中加入1L 100%的乙醇之后，搅拌3小 时抽提叶绿素a。用于提取步骤的小球藻细胞不用声波裂解而使用它们本身 未破碎的形式。虽然抽提叶绿素a通常用有机溶剂处理细胞裂解液，但本实 施例使用小球藻细胞本身而不是它们的裂解液。抽提结果示于图2h中。如图2h所示，观察到叶绿素a峰的保留时间大约在8. 4分钟，而图2a 所示的被大量除去的其它组分的保留时间为2. 5 7. 5分钟。而且，我们发现 在HPLC色谱图中叶绿素a的含量(即纯度)为76.92。/。。同时，方案A的叶绿 素a的收率为7.89%。方，首先，为了除去从Chlorland co， Ltd购买的海水小球藻中的盐份，小 球藻用蒸馏水洗涤然后5000rpm离心收集沉淀。用蒸馏水再次悬浮沉淀物然 后再次离心收集。用蒸馏水洗涤五次后取出少量，用HPLC(高压液相色谱法) 分析叶绿素a和其它组分的含量。HPLC在具有SPD-M10AVP柱的HPLC系统 (Dong-ilShimadzu Corp.)上进行，且进样体积设为20 u 1，流速lml/分钟。 购于Fluka的商品化的叶绿素a作为标准。用500ml的100%的乙醇洗涤lOOg 除去海水的小球藻(非裂解的完整小球藻细胞)，然后5000r"pm离心沉淀，接着仅取叶绿素抽提溶液的上清液过滤。加入70ml的二噁垸和70ml的蒸馏水 到叶绿素提取物中，_201:冷藏超过5小时以促进沉淀作用。然后，滤过沉淀 物，用水洗净，从而获得叶绿素a。之后，为了制备后续的二氢卟酚e6，在 100%的乙醇中溶解沉淀物。如图2i所示，观察到叶绿素a的主峰的保留时间大约在4. 3分钟，而其 它的峰很少见。而且可以从HPLC色谱图中看到叶绿素a的含量(即纯度)为 84.93%。同时，方案B的叶绿素a的收率为4.26Q/0。实验结果表明，在使用二噁垸的情况下，可通过简单过程获得高产率的 叶绿素a。实施例3:从叶绿素a制备二氢口卜酚e6 实麟.'應斷氛素s微成在每1L实施例2的方案A中获得的含有叶绿素a的乙醇提取物中，加入 5 10ml 1NHC1以调节提取物至pH 2 3，然后搅拌3小时除去叶绿素a中 的Mg"，从而获得脱镁叶绿素a(图3a)。然后，黑色的脱镁叶绿素A溶液在 -23X:冷藏保存3 6小时进行沉淀，接着过滤。实蕭",二富輔W微成方,^用丙酮溶解实施例3-1的脱镁叶绿素a沉淀之后，蒸发除去丙酮。用1L 的100%的乙醇溶解脱镁叶绿素a，将含有脱镁叶绿素a的过滤后溶液加入5 10ml的1NNaOH以调整至pH 13 14，搅拌12小时以便从脱镁叶绿素a生成 二氢卟酚e6。之后，加入1N HCl到产物中以中和生成的二氢卟酚e6，然后 过滤，接着完全除去乙醇(图3b)。如图3b的曲线图所示，观察到二氢卟酚 e6峰的保留时间在大约4.987分钟，且发现二氢卟酚e6的含量(纯度)为 97. 66%。最后从100g小球藻中获得48. 6g 二氢卟酚e6(收率4. 86%)。此外，为了制备二氢卟酚e6的盐形式，将3当量的船03或朋03溶解于冰水中，加入二氢卟酚e6，然后冷冻干燥除去水份获得二氢卟酚e6的盐形式。 方彭将实施例3-1的脱镁叶绿素a沉淀溶解于1L丙酮中，加入5 10ml的 1NNaOH调整至pH 13 14，然后搅拌12小时由脱镁叶绿素a生成二氢叶酚e6。过滤收集生成的二氢卟酚e6Na盐沉淀之后，依次用丙酮和核酸洗涤，然 后溶解于少量的水中。用可溶的膜滤器过滤二氢B卜酚e6溶液后，用冷冻干燥 法获得最终的二氢卟酚e6Na盐(图3c)。最终的二氢卟酚e6Na盐为粉状。处 理10L的小球藻(离心之后1 1. 5kg)，最终Na盐二氢卟酚e6的收率为2. 5 3. 0%，即25 30g。此外，二氢卩卜酚e6的纯度为99. 83%。按照方案B， 二氢卟酚e6Na盐是在二氢卟酚e6生产步骤中用NaOH处理 直接形成的。可见该方案与方案A有很大的差异。本发明使用未破碎的小球藻细胞本身提取叶绿素a，从而从该叶绿素a 提取物中制备二氢卟酚e6。通过对本发明中选择的小球藻细胞本身进行预处 理可获得高含量的叶绿素a。该方法按照相对简单的步骤进行，并适合二氢 卟酚e6的大规模生产。已描述了本发明的优选方案，应当理解落入本发明构思内的改变和修饰 对本领域技术人员来说是显而易见的，并且本发明的范围由所附的权利要求 及其等同形式确定。
权利要求
1、一种制备叶绿素a的方法，其包括用有机溶剂处理未破碎的完整小球藻的步骤。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述小球藻是海水小球藻。
3、 根据权利要求l所述的方法，其中，所述有机溶剂是乙醇。
4、 一种制备叶绿素a的方法，其包括以下步骤(a) 用30 8(Fo的乙醇处理小球藻以从小球藻中除去除了叶绿素a以外的 组分；和(b) 用90 100%的乙醇处理该小球藻以提取叶绿素a，由此获得叶绿素a 提取物。
5、 一种制备叶绿素a的方法，其包括以下步骤(a) 用80 100。/。的乙醇处理小球藻以提取叶绿素a;和(b) 用二噁烷处理该提取物以促使叶绿素a沉淀。
6、 一种制备二氢卟酚e6的方法，其包括以下步骤(a) 用酸处理按照权利要求4或5所述的方法获得的叶绿素a以除去叶绿 素a中的Mg 由此获得脱镁叶绿素a;禾口(b) 用碱处理该脱镁叶绿素a以获得二氢卟酚e6。
7、 根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述小球藻是未破碎的完整 细胞。
8、 根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述小球藻是海水小球藻。
9、 根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(a)中的乙醇浓度是50 65%。
10、 根据权利要求9所述的方法，其中，步骤(a)中的乙醇浓度是58 620/0。
11、 根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(a)被重复进行3 6次。
12、 根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(b)中的乙醇浓度是98 100%。
13、 根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(a)中的乙醇浓度是90 100%。
14、 根据权利要求13所述的方法，其中，步骤(a)中的乙醇浓度是98 100%。
15、 根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(b)是通过在加入二噁烷之 后向提取物中加水而进行。
16、 根据权利要求5所述的方法，其中，该方法进一步包括在步骤(b) 后在低于-l(TC下冷却步骤(b)的产物的步骤。
17、 根据权利要求4所述的方法，其中，叶绿素a的收率是7 9%，且 叶绿素a的纯度是72 80%。
18、 根据权利要求5所述的方法，其中，叶绿素a的收率是4 6%，且 叶绿素a的纯度是80 90%。
19、 根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(a)是通过用酸处理叶绿素 a提取物以调整该叶绿素a提取物的pH值至1 5而进行。
20、 根据权利要求19所述的方法，其中，pH值是l 3。
21、 根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(b)是通过用碱处理脱镁叶 绿素a以调整叶绿素a提取物的pH值至11 16而进行。
22、 根据权利要求21所述的方法，其中，pH值是13 14。
23、 根据权利要求6所述的方法，其中，该方法进一步包括在步骤(b) 之后中和步骤(b)的产物的步骤。
24、 根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(b)是在乙醇溶剂存在下进 行的。
25、 根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(b)是在丙酮溶剂存在下进 行的。
26、 根据权利要求25所述的方法，其中，该方法包括以下步骤(a)用 酸处理按照权利要求4或5所述的方法获得的叶绿素a以除去叶绿素a中的 Mg2+，由此获得脱镁叶绿素a的沉淀物；(b-l)向该脱镁叶绿素a的沉淀物中 加入丙酮溶剂以获得脱镁叶绿素a的溶液；和(b-2)用碱处理该脱镁叶绿素a 溶液以获得二氢卟酚e6。
27、 根据权利要求24所述的方法，其中，二氢卟酚e6的纯度是93 98%， 且二氢卟酚e6的收率是4 6°/0。
28、根据权利要求25所述的方法，其中，二氢卟酚e6的纯度是95 99.9%，且二氢卟酚e6的收率是3 50/0。
全文摘要
本发明涉及一种制备叶绿素a和二氢卟酚e6的方法。本发明使用未破碎的小球藻细胞本身提取叶绿素a，从而从叶绿素a提取物中制备二氢卟酚e6。通过对本发明选取的小球藻细胞本身进行预处理步骤可获得高含量的叶绿素a。本方法按照相对简单的步骤实施，并且适合二氢卟酚e6的大规模生产。
文档编号C12N1/12GK101595209SQ200780040924
公开日2009年12月2日 申请日期2007年5月3日 优先权日2006年11月3日
发明者朴智镛, 金孝俊, 金容哲 申请人:光州科学技术院;Ls制药有限公司
文档序号 :
【 439090 】
技术研发人员：金容哲,朴智镛,金孝俊
技术所有人：光州科学技术院,LS制药有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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