百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针，所述蛋白质为如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供相应的核酸序列，以及检测探针；步骤如下：通过RACE技术分别扩增得到APGA20ox基因的3′和5′端，进行基因全长序列拼接和同源性分析，通过时空表达模式分析以及外源调控物质处理，分析APGA20ox基因表达差异情况进而验证基因的功能。为了验证本发明涉及的APGA20ox的功能，通过RNAi技术转化百子莲胚性愈伤组织，APGA20ox基因沉默可以得到矮化的百子莲植株，更加确切表明本发明涉及的APGA20ox核苷酸序列在百子莲株高改良中具有特异的效果。本发明可调控百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因的时空表达特性，进而能够改变植物株高发育。
【专利说明】百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白及其编码基因
和探针
【技术领域】
[0001]本发明涉及百子莲赤霉素合成途径中的关键酶及其编码基因和探针，具体涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白及其编码基因和探针。
【背景技术】
[0002]观赏植物的株型是决定商品价值和观赏价值的重要因素之一。改变和定向调控株型，创造矮化紧凑的株型，可以增加观赏植物的商品价值和观赏价值，通过增加株高可以获得良好的切花性状。赤霉素(Gibberellin，GA)是决定植物茎的伸长的最重要的植物激素，赤霉素的合成和代谢直接调控植物的株型发育。赤霉素种类多样，生物合成途径十分复杂，仅有少数种类的GAs具有生物活性，中间产物大多不具备生物活性，在转化为活性GAs的过程中，必须有GAs合成的双加氧酶类参与，其中GA20ox双加氧酶参与GAs生物合成反应的多个步骤，具有重要的作用，GA20ox的突变体由于GA生物合成途径受阻，多表现为矮化性状。一些研究表明，通过调控GA20ox的表达可以显著改变植物株高，提高农作物抗性和产量，提高观赏植物商品价值。
[0003]GA20ox在一些植物中已被分离，如:杨树(Populus tomentosa)、拟南芥(Arabidopsis thalian a)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、水稻(Oryza sativa)、矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)、大麦(Hordeum vulgare)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、玉米(Zeamays)等,但对于球根花丼百子莲(Agapanthus praecox), APGA20ox基因的克隆、表达模式及APGA20OX蛋白编码序列目前尚不清楚。在本发明被公布之前，未有任何与本专利申请中所提及的百子莲APGA20OX蛋白序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于填补赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因家族成员的克隆、表达以及赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白的空白，提供了一种赤霉素合成双加氧酶蛋白APGA20OX，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了百子莲APGA20OX蛋白及其核酸序列在百子莲不同器官、不同发育阶段的表达模式，为今后利用基因工程技术对APGA20OX基因表达的时空特性进行调控，从而改变株高、创造合理株型提供了理论依据，具有很大的应用价值。
[0005]一方面，本发明提供了具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的蛋白质。该多肽在百子莲发育的不同阶段，不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
[0006]优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0007]进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0008]另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0009]优选的，所述核酸序列具体为:(a)碱基序列如SEQ ID N0.1第I~1086位所示；或(b)与SEQ ID N0.1第I~1086位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能与SEQ ID N0.1第I~1086位所示的核酸进行杂交的序列。
[0010]优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0.1第I~1086位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的序列。
[0011]此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8~100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子莲APGA20ox相关的核酸分子。
[0012]本发明还涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码基因的应用，其所述基因的碱基序列如SEQ ID N0.1第I~1086位所示，所示的应用是:通过基因工程对基因表达进行调控进而改变植株株高，获得新的百子莲株型。 [0013]优选地，所述应用具体为:通过常规手段提高APGA20OX蛋白编码基因的表达量，使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。
[0014]进一步优选地，所述应用具体为:使用GA处理百子莲，使得植株APGA20OX基因表达量提高，进而使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。
[0015]在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0016]在本发明中，术语“百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白编码序列”指编码具有百子莲APGA20OX蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示的第I~1086位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.1所示的第I~1086位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.1所示的第I~1086位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.2所示的序列。该术语还包括与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0017]该术语还包括能编码天然百子莲APGA20OX蛋白的相同功能、SEQ ID N0.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0018]在本发明中，术语“百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白”指具有百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白相同功能的、SEQ ID N0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白的活性片段和活性衍生物。[0019]本发明的百子莲APGA20ox蛋白的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百子莲APGA20OX相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲APGA20OX蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0020]在本发明中，“百子莲APGA20OX保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0021]表1
[0022]
【权利要求】
1.一种如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体如SEQID N0.1第I~.1086位所示。
4.一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20OX蛋白编码基因的应用，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID N0.1第I~1086位所示，所示的应用是:百子莲APGA20ox基因通过RNAi技术沉默，进而能得到矮化的百子莲植株。
【文档编号】C12N15/53GK104017781SQ201410240613
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2013年6月4日
【发明者】申晓辉, 岳建华, 张荻, 任丽 申请人:上海交通大学
文档序号 :
【 478022 】
技术研发人员：申晓辉,岳建华,张荻,任丽
技术所有人：上海交通大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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