一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的用途的制作方法

本发明属于生物工程技术的应用用途，具体涉及一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的用途。

背景技术：

高F 值寡肽混合物是一个由由3～7个氨基酸残氨基酸残基所组成的混合小肽（或称寡肽）体系。F值（Fischer ratio）是指支链氨基酸（BCAA：Val，Ile，Leu）与芳香族氨基酸（AAA：Trp，Tyr，Phe）含量的摩尔数比值。正常人的血液中F值为3.0-3.5，而患有肝脏疾病病人的F值只有1.0或者更低，而高F值寡肽的F值应大于20，远高于人体中这两类氨基酸的比值。由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注。

鲣鱼（Katsuwonus pelamis），属鲈形总目、金枪鱼亚目、金枪鱼科、舵鲣亚科、鲣属，又名正鲣、炸弹鱼、坚鱼、松鱼、飞虎鱼。鲣鱼是大洋性重要经济鱼。鲣鱼分布范围较广，在印度洋、太平洋和大西洋水温高于15 摄氏度以上的水域，都有鲣鱼的踪迹，并且储量丰富、开发利用前景乐观。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂在肝损伤、皮肤光老化、衰老及其它与Nrf2-ARE通路密切相关的疾病方面的用途。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的用途，其特征在于该Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；可促进Nrf2 蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，上调抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物，保护机体免受氧化应激产生的活性氧的损伤；可用作制备肝损伤、皮肤光老化、衰老及其它与Nrf2-ARE通路密切相关的疾病的药品或保健食品。

该激活剂的制备方法为：

（1）金枪鱼碎肉的酶解：取金枪鱼碎肉匀浆，按固液比1 g:10mL～15 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05mol/L，pH 9.5），用HCl或NaOH调节pH到9.0～10.0，将溶液温度调制55～65℃，按照金枪鱼碎肉质量的1.0 %～1.5 %加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×10⁵ U/g），酶解时间3.5 h～4.0 h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至45～55℃，调节pH到6.0～7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.8 %～1.0%加入复合风味蛋白酶（酶活力≥1×10³ LAPU/g），酶解时间2.5 h～3.0 h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于8000～10000 rpm离心15～20 min，取上清液。

（2）金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备：取上述上清液，采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液；将超滤酶解液调pH值至2.5~3.5，按照物料与活性炭颗粒比为10～15:1将超滤酶解液以0.3～0.5mL/min 流速缓慢加入到装载有活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用2～3倍柱体积的1：1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽；将活性炭精制多肽配成10～20 mg/mL的溶液，调pH值至6.5～7.5，缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为10～15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中，用2～3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用2～3倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽。

（3）金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活剂制备：将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf2-ARE通路激活剂。

作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）。

作为优选，所述步骤3）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：

凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20～30 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.5～0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰对Nrf2蛋白质水平的影响，选择Nrf2蛋白质水平最高组分冻干，即为凝胶层析酶解物；

反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90～100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对Nrf2蛋白质水平的影响得1个活性多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI-MS测定分子量为658.76 Da。

再优选，所述反相高效液相色谱条件为：进样量10～15 μL；色谱柱Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈梯度洗脱（0～40min乙腈浓度由0匀速升至50%）；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。

与现在技术相比，本发明所提供的一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；可促进Nrf2 蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，上调抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物，保护机体免受氧化应激产生的活性氧的损伤；可用作制备肝损伤、皮肤光老化、衰老及其它与Nrf2-ARE通路密切相关的疾病的药品或保健食品。

附图说明

图1是本发明的葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析图。

图2葡聚糖凝胶Sephadex G-15制备酶解物的反相高效液相色谱色谱图。

图3 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)对Nrf2蛋白质表达水平的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：

一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的用途的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼碎肉→双酶酶解→酶解物→超滤→活性炭吸附→大孔树脂纯化→金枪鱼高F值寡肽→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→Nrf2-ARE通路激活剂。

（1）金枪鱼碎肉的酶解：取鲣鱼碎肉匀浆，按固液比1 g:12 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05mol/L，pH 9.5），用HCl或NaOH调节pH到9.3，将溶液温度调制60℃，按照金枪鱼碎肉质量的1.2 %加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×10⁵ U/g），酶解时间3.5 h后，酶解液于95℃保温12 min，灭酶活；将酶解液温度调至50℃，调节pH到7.0，按照金枪鱼碎肉质量的0.9%加入复合风味蛋白酶（酶活力≥1×10³ LAPU/g），酶解时间3.0 h，酶解液于95℃保温15min后降至室温，于9000 rpm离心15 min，取上清液。

（2）金枪鱼碎肉高F值寡肽的制备：取上述上清液，采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液；将超滤酶解液调pH值至3.0，按照物料与活性炭颗粒比为12:1将超滤酶解液以0.3mL/min 流速缓慢加入到装载活性炭颗粒的玻璃柱中，上样完成后，采用3倍柱体积的1：1比例的1mol/L氨水和无水乙醇混合溶液洗脱色谱柱，收集洗脱液，干燥，得活性炭精制多肽；将活性炭精制多肽配成15 mg/mL的溶液，调pH值至7.0，缓慢加入到物料与D101大孔树脂比为15:1的装载D101大孔树脂的玻璃柱中，用3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为金枪鱼碎肉高F值寡肽。

（3）金枪鱼碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活剂制备：将金枪鱼碎肉高F值寡肽依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得Nrf2-ARE通路激活剂。

作为优选，所述步骤3）的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：

①凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰对Nrf2蛋白质水平的影响，选择Nrf2蛋白质水平最高组分冻干，即为凝胶层析酶解物Fr.3（图1）。

②反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化（条件为：进样量15 μL；色谱柱Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈梯度洗脱（0～40min乙腈浓度由0匀速升至50%）；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长220 nm。），根据对Nrf2蛋白质水平的影响得1个活性多肽（图2）。

③结构检测：收集对Nrf2蛋白质累计水平最高的多肽，经反相高效液相色谱检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI-MS测定分子量为658.76 Da。

自由基清除实验：将制得的金枪鱼碎肉多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)进行自由基清除实验。实验结果表明：Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)对羟基自由基（EC₅₀ 0.12 mg/mL）和超氧阴离子自由基（EC₅₀ 0.06 mg/mL）具有良好的清除作用。

抗氧化肽对激活Nrf2/ARE 通路的作用：取对数生长期的人胚肾细胞株HEK293 细胞接种于60mm 皿24 小时后，分别加入10μM的酶解液和Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，继续培养4 小时。弃去上清，细胞用RIPA 缓冲液( 上海碧云天生物技术有限公司) 裂解，BCA 法测定蛋白浓度。每个样品取20μg 蛋白经SDS-PAGE分离，然后按常规免疫印迹方法检测Nrf2的蛋白水平。

与现在技术相比，本发明所提供的一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；可促进Nrf2 蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，上调抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物，保护机体免受氧化应激产生的活性氧的损伤；可用作制备肝损伤、皮肤光老化、衰老及其它与Nrf2-ARE通路密切相关的疾病的药品或保健食品。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 一种金枪鱼高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活剂的用途

<130> zjou-wb-201602-102

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ile Glu Leu Val Trp

1 5