己二酸的制备的制作方法
己二酸的制备本发明涉及用于制备己二酸的方法。本发明还涉及使用这样制备的己二酸来制备聚酰胺或酯的方法。本发明还涉及可用于本发明方法中的异源细胞。本发明还涉及异源细胞中己二酸制备中的用途。己二酸(肥酸)等等被用于生产聚酰胺。另外，己二酸酯可在增塑剂、润滑剂、溶剂和多种聚氨酯树脂中使用。己二酸的其它一些用途是用作食物酸化剂，应用于粘附剂、杀虫剂、制革剂(tanning)和染料中。已知的制备方法包括用硝酸氧化环己醇或环己酮或其混合物(KA油)。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己二酸的中间产物来制备己二酸。此外，期望提供一种方法，其比利用来自石油化工来源的散装化学品的常规化学方法需要的能量更少。本发明的一个目的是提供制备己二酸的新方法。另一个目的是提供新的生物催化剂，其适于催化己二酸制备方法中的一个或多个反应步骤。根据本发明可以解决的一个或多个其它目的将在下文描述。本发明人认识到，可以使用特异性生物催化剂来制备己二酸。因此，本发明涉及用于制备己二酸的方法，其包括-将α-酮戊二酸(AKG)转化成α -酮己二酸(AKA)，-将α-酮己二酸转化成α -酮庚二酸(AKP)，-将α-酮庚二酸转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)，和-将5-甲酰基戊酸转化成己二酸，其中这些转化中至少一种使用生物催化剂(特别是异源生物催化剂)进行。在一个优选实施方案中，AKG到AKA的转化由生物催化剂进行催化。在另一个优选实施方案中，AKA到AKP的转化由生物催化剂进行催化。在另一个优选实施方案中，AKP到5-FVA的转化由生物催化剂进行催化。5-FVA到己二酸的转化可具体包括醛氧化步骤，所述氧化可以以化学方法进行，或以生物催化方法进行。本发明还涉及包含一种或多种核酸序列的异源细胞，所述核酸序列编码一种或多种酶，所述酶在对5-甲酰基戊酸向己二酸的转化方面具有催化活性。本发明还提供包含一种或多种核酸序列的异源细胞，所述核酸序列编码一种或多种异源酶，所述酶能够催化由α-酮戊二酸制备己二酸的至少一个反应步骤。这些细胞特别地可用作己二酸制备方法中的催化剂。本发明使得可以从可再生资源制备己二酸，而不需要石油化工原料。特别地，预想本发明方法可以以高成本效率或高能量效率的方式操作。除非另有说明，否则本文所用术语“或”定义为“和/或”。除非另有说明，本文中使用的术语“一个”(“a”或“an”)被定义为“至少一个”。提到单数名词(例如化合物、添加剂等等)时，旨在包括复数在内。因此，除非另有说明，否则提到特定部分(如“化合物”)时，这是指“至少一个”该部分，例如“至少一个化合物”。除非另有说明，在本文中提到羧酸或羧酸酯(例如氨基酸、5-FVA、AKG、AKA、AKP、 己二酸/己二酸酯)时，这些术语旨在包括质子化的羧酸(游离酸)、相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。同样，提到胺时，这旨在包括质子化的胺(通常为阳离子，如R-NH3+)和非质子化的胺(通常不带电，如R-NH2)。提到氨基酸时，所述术语旨在包括两性离子形式(其中氨基被质子化且羧酸酯基是去质子化的形式)的氨基酸，其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的
Τττ . ο提到存在若干异构体(例如顺式和反式异构体、R和S对映异构体)的化合物时， 化合物原则上包括可在本发明具体方法中使用的所述化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体。参考括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biο1οgy(NC-1UBMB)提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见 http://www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其它合适的酶旨在包括在内。除非另有说明，本文参考登记号提到蛋白质或基因时，所述登记号尤其被用于表示具有在2008年3月11日在Uniprot中找到的序列的蛋白质或基因。本文所用术语核酸的“功能类似物”至少包括编码具有相同氨基酸序列的酶的其它序列，以及编码这些酶的同源物的其它序列。术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30%、优选地至少40%、更优选地至少 60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其是至少85 %、更尤其是至少90 %、至少91 %、92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多多肽序列或两条或更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括 BLASTP 和 BLASTN (Altschul，S. F. et al. ,J. Mol. Biol. 1990，215，403-410)，公众可以从 NCBI 和其它来源(BLAST Manual, Altschul, S. , et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5， Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸 0. 5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。
本文所用的异源生物催化剂(特别是异源细胞)是包含异源蛋白或异源核酸(通常是作为细胞的DNA或RNA的一部分)的生物催化剂。用于核酸序列(DNA或RNA)或蛋白质时，术语“异源”指这样的核酸或蛋白质，其不作为所存在生物、细胞、基因组或DNA或 RNA序列中的天然部分而存在，或者存在于与其自然界中不同的细胞或者位置或者基因组或DNA或RNA序列的位置。应该理解，异源生物中的异源DNA是该异源生物基因组的一部分。异源核酸或蛋白质对于其所引入的细胞而言不是内源的，而是得自其它细胞或者是合成或重组产生的。通常(但不一定)，这些核酸编码不在转录或表达该DNA的细胞中天然产生的蛋白质。类似地，异源RNA编码不在该异源RNA所存在细胞中天然表达的蛋白质。异源核酸和蛋白质还可称为外源核酸或蛋白质。术语异源核酸或蛋白质包括本领域技术人员认为对于表达细胞而言是异源或外源的任何核酸或蛋白质。提到来自特定来源的酶或其它生物催化部分时，来自第一种生物但实际在另一 (遗传修饰的)生物中产生的重组酶或其它重组生物催化部分也明确地包括在内，作为来自该第一种生物的酶或其它生物催化部分。在本发明方法中，使用了生物催化剂，即，该方法的至少一个反应步骤由来自生物来源(例如生物或由其衍生的生物材料)进行催化。生物催化剂特别地包括一种或多种酶。生物催化反应可包括一种或多种化学转化，其中至少一种由生物催化剂进行催化。因此，“生物催化剂“可加速由AKG制备AKP的至少一个反应步骤、由AKP制备5-FVA的至少一个反应步骤或者由5-FVA制备己二酸的至少一个反应步骤中的化学反应。生物催化剂可以任何形式使用。在一个实施方案中，一种或多种酶形成活生物的一部分(如活的完整细胞)。酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。在一个实施方案中，使用从天然环境中分离(从生产它们的生物中分离) 的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞(悬浮液)、裂解物、或固定在支持物上。考虑到调节反应条件时使得反应平衡向想要的一侧偏移的提高的灵活性，从酶的来源生物中分离的酶的用途尤其是有用的。活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠(dormant)细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化(即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部分。(本发明方法中使用的)生物催化剂原则上可以是任何生物，或者得自或来自任何生物。该生物可以是天然生物或异源生物。所述异源生物通常是包含编码异源酶的至少一种核酸序列的宿主细胞，所述异源酶能够催化本发明方法的至少一个反应步骤。异源核酸序列的来源生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可独立地选自动物(包括人)、植物、细菌、古细菌(archaea)、酵母和真菌。所述宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞。在一个实施方案中， 宿主细胞选自真菌、酵母、裸藻(euglenoid)、古细菌和细菌。宿主细胞可特别地选自 以下属:Aspergillus, Penicillium, Ustilago, Cephalosporium, Trichophytum, Paecilomyces, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Azotobacter, Frankia, Rhizobium, Bradyrhizobium, Anabaena, Synechocystis, Microcystis, Klebsiella, Rhodobacter, Pseudomonas,Thermus,Deinococcus Gluconobacter,Methanococcus, Methanobacterium,Methanocaldococcus, Methanosphaera, Methanobrevibacter, Methanospirillum 禾口 MethanosBrciriBo特别地，宿主菌株(和因此用于本发明方法的宿主细胞)可选自Escherichia coli，Azotobacter vinelandii，Klebsiella pneumoniae，Anabaena sp.，Synechocystis sp. ， Microcystis aeruginosa， Deinococcus radiourans， Deinococcus geothermalis， Thermus thermophilus， Bacillus subtilis， Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus methanolicus， Corynebacterium glutamicum， Aspergillus niger， Penicillium chrysogenum，Penicillium notatum，Paecilomyces carneus，Cephalosporium acremonium， Ustilago maydis， Pichia pastoris， Saccharomyces cerevisiae， Kluyveromyces lactis，Candida maltosa,Yarrowia lipolytica，Hansenula polymorpha， Sulfolobus solfataricus， Methanobacterium thermoautothrophicum， Methanococcus maripaludis, Methanocaldococcus jannashii，Methanosphaera stadtmanae， Methanococcus voltae, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri， Methanosarcina mazei， Methanosarcina acetivorans， Methanospirillum hungatei， Methanosaeta thermophila Methanobrevibacter smithii,Methanococcus vannielii 禾口 Methanococcus aeolicus 宿主细胞。下述会被认为是有利的宿主细胞是天然地能将5-FVA转化成己二酸或至少能催化必要反应之一的生物。在一个具体实施方案中，对5-甲酰基庚酸转化成己二酸具有催化活性的酶包含 SEQ ID NO :285, SEQ ID NO :287所示序列或其同源物。例如，这种酶由分别包含SEQ ID NO :284, SEQ ID NO :286所示序列的基因编码。本领域技术人员基于常识将能够获得可用作替代的这些序列的功能类似物。有利地，宿主细胞是这样的生物，其包含催化赖氨酸生物合成的氨基己二酸途径 (也称为AAA途径)或其部分的生物催化剂(如低等真核生物真菌、酵母、裸藻，某些细菌如Thermus，Deinococcus,古细菌)，或者包含通过固氮酶进行氮固定的生物催化剂。在一个优选实施方案中，宿主细胞是具有通过AAA途径的高流量的生物，例如 Penicillium chrysogenum, Ustilago maydis,或者对赖氨酸生产进行了改造(优选优化) 的生物。高流量定义为在选定生产条件下供应相应生物中细胞蛋白质生物合成所需赖氨酸速率的至少20%，更优选至少50%，甚至更优选至少70%，最优选至少100%。在一个优选实施方案中，宿主细胞是产生高水平高柠檬酸的生物，其可以是天然的或是异源生物。这种生物可通过表达用于形成固氮酶中必要辅因子的高柠檬酸合酶或其同源物来获得。在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于动物(特别是其部分，如肝、胰、脑、肾、 心或其它器官)的异源核酸序列。动物可特别地选自哺乳动物，更特别地选自L印oridae， Muridae，Suidae 禾口 Bovidae0在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于植物的异源核酸序列。合适的植物特别地包括选自以下的植物Asplenium ；Cucurbitaceae，特别是 Curcurbita，例如 Curcurbita moschata(侯瓜)，或 Cucumis ；Brassicaceae,特别是 Arabidopsis,例如 k. thaliana ； Mercurialis,例如 Mercurialis perennis ；Hydnocarpus ；禾口 Ceratonia0
在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于细菌的异源核酸序列。合适的细菌特别地可选自 Vibrio, Pseudomonas, Bacillus， Corynebacterium, Brevibacterium， Enterococcus，Streptococcus, Actinomycetales，Klebsiella，Lactococcus, Lactobacillus， Clostridium， Escherichia， Klebsiella， Anabaena， Microcystis, Synechocystis, Rhizobium， Bradyrhiζobium, Thermus, Mycobacterium, Zymomonas, Proteus， Agrobacterium， Geobaci1lus, Acinetobacter， Azotobacter， Ralstonia， Rhodobacter, Paracoccus， Novosphingobium， Nitrosomonas， Legionella， Neisseria， Rhodopseudomonas，Staphylococcus,Deinococcus 禾口 Salmonella。在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于古细菌的异源核酸序列。合适的古细菌特别地可选自 Archaeoglobus, Aeropyrum, Halobacterium, Methanosarcina, Methanococcus, Thermop1asma， Thermococcus， Pyrobaculum, Pyrococcus, Sulfolobus, Methanococcus, Methanosphaera, Methanopyrus, Methanobrevibacter, Methanocaldococcus 禾口 Methanobacterium0在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于真菌的异源核酸序列。合适的真菌特别地可选自 Rhizopus, Phanerochaete, Emericella, Ustilago, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Paecilomyces, Trichophytum 禾口 Aspergillus。在一个实施方案中，宿主细胞包含来源于酵母的异源核酸序列。合适的酵母特别地可选自 Candida，Hansenula，Kluyveromyces, Yarrowia, Schizosaccharomyces, Pichia， Yarrowia 禾口 Saccharomyces0本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的生物催化剂(野生型，其中表达天然生物催化部分)或天然存在的生物催化部分的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计(rational design) 改进天然存在的生物催化部分的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化部分的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如酶)。它们包括随机诱变、定点诱变、定向进化和基因重组。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述方法。突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、PH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。根据本发明，从AKG制备AKP。AKG原则上可以任何方式获得。特别地，AKG可通过为异源生物催化剂提供可转化成AKG的合适碳源(例如通过使碳源发酵)而以生物催化方式获得。在一个有利方法中，利用对碳源进行完整细胞转化以形成AKG来制备AKG。碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物一元醇、多元醇、羧酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形式提供，优选地为植物来源。尤其可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产品 (优选农业废料)中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物葡萄糖、果糖、蔗糖、 乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包含葡萄糖的多糖。在本发明的一个实施方案中，使用将AKG转化成AKA的生物催化剂将AKG转化成 AKA,所述生物催化剂的一部分来源于赖氨酸生物合成的AAA途径。这种转化可包括一个或多个反应步骤，所述步骤可由一种或多种生物催化剂催化。用于催化将AKG转化成AKA的生物催化剂或其部分可以是同源或异源的。特别地， 形成赖氨酸生物合成AAA途径一部分的生物催化剂可见于选自以下的生物中酵母、真菌、 古细菌禾口细菌，特另Ij是选自 Penicillium, Cephalosporium, Paecilomyces, Trichophytum, Aspergillus, Phanerochaete, Emericel la, Ustilago, Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Hansenula, Thermus, Deinococcus, Pyrococcus, Sulfolobus, Thermococcus, Methanococcus, Methanosarcina, Methanocaldococcus, Methanosphaera, Methanopyrus, Methanobrevibacter, Methanospirillum和Methanothermobacter。合适的生物催化剂可见于能产生高柠檬酸的生物中，例如固氮菌如蓝细菌(如Anabaena，Microcystis, Synechocystis)、根瘤菌(如 Rhizobium, Bradyrhizobium)、变形菌(proteobacteria)(如 Pseudomonas, Azotobacter, Klebsiella)和放线菌(如Frankia)的固氮酶复合物的生物催化剂。因此，使用基于天然包含赖氨酸生物合成AAA途径或其部分的宿主细胞的生物催化剂，则该系统可以是同源的。在本发明的一个优选实施方案中，期望通过生物催化剂实现AKA的高生产力。含有赖氨酸生物合成AAA途径或其部分的生物催化剂可通过本领域已知方法进行修饰(例如突变/筛选或代谢工程)以实现该效果。AKA的高水平可以通过提高其形成所涉及的酶活性和/或降低其转化(例如转化成氨基己二酸)所涉及的活性来产生。AKA形成所涉及的酶包括高柠檬酸合酶(EC 2. 3. 3. 14)高乌头酸酶(EC 4. 2. 1. 36)和高异柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 87)。这些酶在宿主细胞中的活性可通过本领域已知方法来提高，例如(过)表达编码相应酶和/或功能同源物的基因，减轻底物、产物或其它化合物的抑制，或通过分子进化或推理性设计来提高这些酶的催化特性。进行定向进化的优选方法可基于WO 2003/010183。由于期望所产生的AKA转化成氨基己二酸(AAA)——这将是赖氨酸生物合成途径中的另一步——所以优选的是所述异源生物催化剂不具有催化该转化的酶(特别是氨基转移酶如氨基己二酸氨基转移酶(EC 2.6. 1.39)或能催化该反应的氨基酸脱氢酶)的活性， 或该活性很低。因此，对于提供该生物催化剂的宿主细胞包含编码这种酶之基因的情况，优选对该基因进行失活、敲除，或降低该基因的表达。由于这一步是赖氨酸产生的AAA途径中必要的，所以具有供应生长和维持所需赖氨酸量的有限最低活性但不能够将AKA高水平转化成AAA的宿主细胞是有利的。特别地，对于宿主为Penicillium chrysogenum的情况，氨基转移酶可具有SEQ ID NO 68的序列或其同源物。可以通过若干方法来失活编码不期望活性的基因。一种方法是使用翻译分子或RNAi分子的瞬时方法(例如基于Kamath et al. 2003. Nature 421:231-237)。另一种是使用调节型启动子系统，其可使用外来触发剂(如四环素)进行开关(例如基于Park and Morschhauser, 2005, Eukaryot. Cell. 4 :13沘_1；34幻。另一种是应用化学抑制剂或蛋白抑制剂或物理抑制剂(例如基于iTour et al. 2003. Nat Biotech 21 :1505-1508)。优选得多的方法是除去编码不期望活性的完整基因或其部分。为了或者这样的突变体，可以应用本领域已有方法，例如单交叉重组或双同源重组。为此，需要构建整合型克隆载体，其可整合在宿主细胞染色体的预定靶位点处。在本发明的一个优选实施方案中，整合型克隆载体包含 DNA片段，其与宿主细胞基因组中预定靶位点的DNA序列同源，用于将克隆载体的整合靶向至该预定位点。为了促进靶向整合，该克隆载体优选在转化宿主细胞前线性化。优选进行线性化以使得克隆载体的至少一个末端(优选两个末端)的侧翼为与靶位点同源的序列。靶位点侧翼的同源序列的长度优选为至少0. 11Λ，甚至更优选至少0. 21Λ，更优选至少0. 5kb, 甚至更优选至少11Λ，最优选至少21Λ。实验中最终的最适长度取决于生物、靶DNA的序列和长度。优选地，通过宿主细胞增强的同源重组能力来提高核酸构建体通过同源重组靶向整合至宿主细胞基因组(即整合在预定靶位点)的效率。细胞的这种表型优选涉及WO 05/956 所述缺陷型hdfA或hdfB基因。WO 05/956 公开了获得靶向整合效率提高的丝状真菌细胞的方法，其通过阻止DNA片段在基因组中的非同源随机整合来实现。载体系统可以是单个载体或质粒，或者两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA。可通过原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生来转化真菌细胞。用于转化真菌宿主细胞的合适方案描述于 EP 238023 或 Yelton et al. (1984. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:1470-1474)。使用根癌农杆菌转化丝状真菌宿主细胞的合适方案描述于de Groot M. J. et al. (1998. Nat. Biotechnol. 16 :839-842. Erratum in :Nat. Biotechnol. 1998. 16 1074)。也可以应用其它方法，如针对Neurospora crassa描述的电穿孔。使用共转化来转染真菌细胞，即，将目的基因与选择标记基因一起转化。这可以是与目的基因物理连接(如在质粒上)，或在单独的片段上。转染后，对转化体筛选该选择标记基因的存在，随后分析在优选预定基因组位点的整合。选择标记是提供针对杀生物剂或病毒的抗性、重金属抗性、原养型或营养缺陷型等的产物。有用的选择标记包括但不仅限于 amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)，bar (膦丝菌素乙酰转移酶)，hygB (潮霉素磷酸转移酶)，niaD (硝酸还原酶)，pyrG (乳清苷-5 ‘-磷酸脱羧酶)，sC或sutB (硫酸腺苷转移酶)，trpC(氨基苯甲酸合酶)，ble (腐草霉素抗性蛋白)及其等同物。最优选的情况是提供第一 DNA片段的DNA分子，所述第一 DNA片段包含期望的取代序列(及选择标记基因)，其5’和3’侧翼是与靶序列侧翼染色体DNA序列基本同源的DNA序列。可以通过第一 DNA片段中选择标记的存在情况来选择染色体DNA序列的靶序列替换为期望的取代序列的细胞。为了提高选择正确突变体微生物菌株的相对频率，可以将包含表达盒的第二 DNA 片段与上述片段可操作地连接，所述表达盒包含编码选择标记的基因和在真核细胞中有功能的调节序列(即，靶位点的5’侧翼+选择标记基因+靶位点的3’侧翼)，并可通过第一 DNA片段中存在选择标记和不存在所述第二选择标记来选择染色体DNA序列中靶序列被替换为期望的取代序列的细胞。
对于形成赖氨酸生物合成的氨基己二酸途径的酶系统对宿主细胞而言是异源的情况下，优选宿主细胞中不包含编码催化酮己二酸转化成氨基己二酸的酶的基因。术语“酶系统”在本文中特别指可催化特定转化的单个酶或酶组。所述转化可包括有已知或位置中间体的一个或多个化学反应，例如AKG转化成AKA或AKA转化成AKP。这种系统可以存在与细胞中，或者从细胞中分离出来。已知氨基转移酶经常具有宽底物范围。可能期望降低宿主细胞中一种或多种这些酶的活性，以使得AKA向AAA的转化被降低，而同时维持其它氨基酸或细胞组分的生物合成的相关催化功能。还优选不含有导致AKA转化成不期望副产物的任何其它酶活性的宿主细胞。在另一实施方案中，AKG转化成AKA，其中利用催化AKG C1延伸成AKA的至少一种异源生物催化剂。所述生物催化剂可包括来源于一种或多种来源生物的一种或多种酶(例如包括来源于不同来源生物的多于一种酶)。特别地，用于由AKG制备AKA的合适生物催化剂选自催化α-酮戊二酸C1延伸成α-酮己二酸和/或α-酮己二酸C1延伸成α -酮庚二酸的生物催化剂。其后，由AKG制备的AKA可转化成ΑΚΡ，其中利用催化AKA延伸成AKP的至少一种异源生物催化剂。这些生物催化剂可以与催化AKG通过C1延伸转化成AKA的生物催化剂相同或不同。可以使用一种或多种生物催化剂将AKA转化成ΑΚΡ。所述生物催化剂可包括来源于一种或多种来源生物的一种或多种生物催化剂(例如包括来源于不同来源生物的多余一种酶)。利用C1延伸的生物合成途径已知作为辅酶B生物合成的一部分和生物素生物合成的一部分存在于产甲烷古细菌中。辅酶B被认为是这些生物中甲烷产生所必需的，α -酮辛二酸是辅酶B生物合成中的一种重要中间体。在这些产甲烷古细菌中，α-酮戊二酸在多个反应步骤中通过逐步添加亚甲基而转化成α-酮己二酸，然后转化成α-酮庚二酸，最终转化成α -酮辛二酸(也参见
图1)a. Cn的α -酮酸+乙酰CoA ―高η柠檬酸+CoA_SH(图1的步骤1、5和9)b.高11柠檬酸一一高11_乌头酸(由高n-柠檬酸脱水酶催化(图1的步骤2、6和 10)c.高 乌头酸一一异高n_柠檬酸(图1的步骤3、7和11)d.高n_异柠檬酸+NADP+ —长度Cn+1的α -酮酸+NADPH+H++0)2 (图1的步骤4、8 和⑵其中η选自1-4。B Ι # X^t Zfe ψMethanosarcina thermophila 禾口 Meth;anoc;aldococcus jarmashii描述了这一重复反应顺序。其它代谢途径中其它α -酮羧酸的C1延伸涉及相似的非重复性反应，例如氧化柠檬酸循环中草酰乙酸转化成α -酮戊二酸，作为亮氨酸的异丙基苹果酸途径的一部分的α-异戊酸转化成α-异己酸，赖氨酸的AAA途径中α -酮戊二酸转化成α-酮己二酸，异亮氨酸的丙酮酸途径中丙酮酸转化成α-酮丁酸，以及马来酸转化成丙酮酸。这些反应统称为"C1延伸”。已经描述了和表征了来自Μ. jarmashii的涉及C1延伸的若干基因和酶。这些酶及其编码基因显示彼此相似，并与其它生物中参与C1延伸的其它酶及其编码基因相似。将 α-酮戊二酸经α-酮己二酸和α-酮庚二酸反复延伸成α-酮辛二酸的一个酶的亚组称为“Aks”。已经在Μ. jarmashii基因组中鉴定了编码这些酶的基因中的一些，并提出了另一些。本发明人意识到，通过向合适的宿主细胞中掺入编码参与C1延伸之酶系统的一种或多种核酸序列，C1延伸可用于以工业规模制备AKA或AKP，这样AKA或AKP可供作为制备己二酸的中间体。特别地，用于催化C1延伸从而形成AKA或AKP的酶系统可包括选自以下的一种或多种酶高n_柠檬酸合酶、高n_顺乌头酸酶和异高n_柠檬酸脱氢酶，其中η选自1至4。特别地，高η-柠檬酸合酶可催化C1延伸中的“反应a”。高n_柠檬酸合酶定义为能使链长的α-酮二酸与乙酰CoA缩合而形成高n-柠檬酸的酶，其中η选自1至4。特别地，高 -柠檬酸合酶可以是EC 2. 3. 3或归类为EC 2.3.3。更特别地，合适的高η-柠檬酸合酶可选自高柠檬酸合酶(EC 2. 3. 3. 14)，或者可归类为EC 2. 3. 3. 1,2. 3. 3.2,2. 3. 3.4 或2. 3. 3. 9。特别优选的是具有高(n)柠檬酸活性的AksA或其同源物。特别地，高η-顺乌头酸酶可催化C1延伸中的“反应b ”和/或“反应c ”。高n_顺乌头酸酶定义为能将高n_柠檬酸经过高n_顺乌头酸中间体转化成异高n_柠檬酸或至少一个可逆半反应(即高n_顺乌头酸至高n-柠檬酸或高n_顺乌头酸至异高 _柠檬酸)的酶，其中η选自1至4。特别地，高η-顺乌头酸酶可以是EC 4.2. 1，或可归类为EC 4.2.1。 更具体地，合适的高η-顺乌头酸酶可选自高顺乌头酸酶(EC 4.2. 1.36)，或者可归类为EC 4.2. 1. 3,4. 2. 1. 33,4. 2. 1. 79和4. 2. 1.99。特别优选的是选自以下的酶AksD、AksE、具有高n_顺乌头酸酶活性的AksD同源物和AksE同源物。特别地，高n-异柠檬酸脱氢酶可催化C1延伸中的“反应d”。异高n_柠檬酸脱氢酶定义为能将异高n_柠檬酸转化成链长Cpn的α -酮二酸并由此释放(X)2的酶，其中 η选自1至4。特别地，异高η-柠檬酸脱氢酶是EC 1.1.1，或可归类为EC 1.1.1。更特别地，合适的异高η_柠檬酸脱氢酶可选自异高柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 87)，或可归类为 EC 1. 1. 136,1. 1. 137,1. 1. 1. 38,1. 1. 139,1. 1. 1. 40,1. 1. 1. 41,1. 1. 1. 42,1. 1. 1. 82、 1. 1. 1.83,1. 1. 1.84,1. 1. 1. 85和1. 1. 1. 2860特别优选的是AksF或其具有高n-异柠檬酸脱氢酶活性的同源物。产甲烷菌可作为生产AKP的生物催化剂，或者可用作这些生物催化剂的来源。可通过检索与来自C1延伸途径的已知酶相似的蛋白质和核苷酸序列来鉴定合适的生物催化剂。可以使用本领域熟知的生物信息学技术在序列数据库中高效地鉴定相似的序列。可以使用本领域已知的分子生物学方法(如Southern杂交或使用简并寡核苷酸的PCR技术) 在培养生物和环境样品中鉴定相似的基因。克隆和测序后，这些生物催化剂可在异源宿主中用于生产AKP。特别地，可以使用来自选自以下的产甲烷菌的一种或多种催化C1延伸的醜Methanococcus， Methanospirillum, Methanocaldococcus, Methanosarcina， Methanothermobacter, Methanosphaera， Methanopyrus 禾口 Methanobrevibacter0 更特别地，可以使用来自选自以下的产甲烷菌的一种或多种酶=Methmothermobacter thermoautotropicum， Methanococcus maripaludis， Methanosphaera stadtmanae， Methanopyrus kandleri， Methanosarcina thermophila， Methanobrevibacter smithii， Methanococcus vannielii， Methanospirillum hungatei， Methanosaeta thermophilaMethanosarcina 已cetivorans 禾口 Methanococcus 已eolicus。此外，用于催化AKG和/或AKA的C1延伸的合适酶例如可见于这样的生物中，所述生物包含催化通过氨基己二酸途径进行赖氨酸生物合成的酶系统或其部分，或者包含其同源物作为其它代谢的一部分，例如参与氮固定的高柠檬酸合酶。特别是选自以下的生物酵母禾口真菌，例如 Penicillium,Cephalosporium, Aspergillus,Phanerochaete,Emericella, Ustilago， Paecilomyces， Trichophytum， Yarrowia, Hansenula， Schizosaccharomyces, Saccharomyces，Candida，Kluyveromyces，特别是 Penicillium chrysogenum，Penicillium notatum， Paecilomyces carneus， Paecilomyces persinicus， Cephalosporium acremonium，Aspergillus niger，Emericella nidulans，Aspergillys oryzae, Ustilago maydis，Schizosaccharomyces pombe，Saccharomyces cerevisiae,Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha， Candida albicans， Candida maltosa 禾口 Kluyveromyces lactis ；细菌，如 Azotobacter, Pseudomonas, Klebsiella， Deinococcus， Thermus,特另lj 是 Azotobacter vinelandii，Pseudomonas stutzerii，Klebsiella pneumoniae， Deinococcus radiourans， Deinococcus geothermalis， Thermus thermophilus ；古细菌，如 Pyrococcus, Sulfolobus， Thermococcus， Methanococcus， Methanocaldococcus, Methanosphaera, Methanopyrus, MethanospirilIum, Methanobrevibacter， Methanosarcina 禾口 Methanothermobacter，特别是 Pyrococcus horikoshii，Sulfolobus solfataricus,Thermococcus kodakarensis，Methanococcus maripaludis，Methanococcus aeolicus， Methanococcus vannielii， Methanocaldococcus jannashii， Methanosphaera stadtmanae， Methanopyrus kandleri， Methanobrevibacter smithii， Methanosarcina thermophiIus，Methanospiri1Ium hungatei，Methanosaeta thermophila，Methanosarcina acetivorans 禾口 Methanothermobacter thermoautotrophicum。特另lj地，这些酵母、真菌、细菌、古细菌或其它生物可提供能催化AKG延伸成AKA(和任选地AKA延伸成APK)中的“反应 a”的高柠檬酸合酶。此外，用于催化AKP制备中反应步骤的合适生物催化剂可见于Asplenium或 Hydnocarpus，特另U是Asplenium septentrionale 或Hydnocarpus anthelminthica，其天然地能够产生AKP。在一个优选实施方案中，使用选自以下的一种或多种酶Aks及其同源物，特别是选自AksA、AksD. AksE. AksF及其同源物。这些Aks酶同源物的实例以及编码这些酶的基
因在下表中给出。
权利要求
1.用于制备己二酸的方法，其包括-将α -酮戊二酸(AKG)转化成α -酮己二酸(AKA)，-将α -酮己二酸转化成α -酮庚二酸(AKP)，-将α -酮庚二酸转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)，和-将5-甲酰基戊酸转化成己二酸，其中这些转化中至少一种使用生物催化剂进行。
2.根据权利要求1的方法，其中使用异源生物催化剂。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述α-酮戊二酸利用生物催化方法从碳源制备的，特别是从碳水化合物制备的。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述生物催化剂包括催化α-酮戊二酸至α-酮己二酸的C1延伸和/或α -酮己二酸至α -酮庚二酸的C1延伸的生物催化剂。
5.根据权利要求3的方法，其中所述生物催化剂包含a.具有高(n)柠檬酸活性的AksA酶或其同源物；b.至少一种下述的酶，所述酶选自具有高n_乌头酸酶活性的AksD酶、具有高n_乌头酸酶活性的AksE酶、所述AksD酶的同源物和所述AksE酶的同源物；和c.具有高n_异柠檬酸脱氢酶活性的AksF酶或其同源物。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述酶系统是来源于下述生物的酶系统，所述生物选自产甲烷古细菌的组，特别是选自Methanococcus，Methanocaldococcus, Methanosarcina, Methanothermobacter, Methanosphaera, Methanopyrus 禾口 Methanobrevibacter 的会且。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物催化剂包括催化将α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶系统，其中所述酶系统形成赖氨酸生物合成的氨基己二酸途径的一部分。
8.根据权利要求7的方法，其中所述酶系统来自选自酵母、真菌、古细菌和细菌的组的生物，特别是选自 Penicillium, Cephalosporium, Paelicomyces, Trichophytum, Aspergillus，Phanerochaete，Emericel la, Ustilago，Schi zosaccharomyces, Saccharomyces， Candida， Yarrowia， Pichia， Kluyveromyces, Thermus, Deinococcus， Pyrococcus， Sulfolobus， Thermococcus， Methanococcus， MethanocaIdococcus, Methanosphaera， Methanopyrus, Methanobrevibacter， Methanosarcina 禾口 Methanothermobacter 的组。
9.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述生物催化剂，特别是所述异源生物催化剂，包含催化将α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶系统，其中所述酶系统中的至少一种酶来源于固氮细菌，所述固氮细菌选自蓝细菌、根瘤菌、变形菌和放线菌的组，特别是选自 Anabaena, Microcystis, Synechocystis, Rhizobium，Bradyrhizobium, Pseudomonas, Azotobacter, Klebsiella 禾口 Frankia 的组。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中α-酮庚二酸被以生物催化方式脱羧，由此形成5-甲酰基戊酸。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，所述方法包括通过醛氧化酶使5-甲酰基戊酸转化成己二酸。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法在发酵条件下进行。
13.异源细胞，其包含编码一种或多种下述酶的一种或多种核酸序列，所述酶具有关于 5-甲酰基戊酸向己二酸的转化的催化活性。
14.根据权利要求13的异源细胞，其中所述具有关于5-甲酰基戊酸向己二酸的转化的催化活性的酶包含SEQ ID NO :285, SEQ ID NO :287所示序列或其同源物。
15.根据权利要求14的异源细胞，其包含编码一种或多种下述异源酶的一种或多种核酸序列，所述异源酶能催化由α-酮戊二酸制备α-酮庚二酸的至少一个反应步骤。
16.根据权利要求14或15的异源细胞，其中所述细胞不含能催化α-酮己二酸向 α-氨基己二酸的转化的氨基转移酶。
17.根据权利要求14至16中任一项的异源细胞，其包含编码SEQID NO :4_77中任一序列所示酶或其同源物的至少一种核酸序列。
18.根据权利要求14至17中任一项的异源细胞，其包含编码SEQID NO :78-81所示酶或其同源物的至少一种核酸序列。
19.根据权利要求14至18中任一项的异源细胞，其包含下述核酸序列，所述核酸序列编码具有使α-酮庚二酸脱羧形成5-甲酰基戊酸的催化活性的酶，特别是选自脱羧酶 (E.C.4. 1. 1)的组的酶，更特别地，选自谷氨酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 15)、二氨基庚酸脱羧酶 (EC 4. 1.1. 20)、天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4. 1.1. 11)、支链α -酮酸脱羧酶、α -酮异戊酸脱羧酶、α -酮戊二酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 1)和草酰乙酸脱羧酶(E. C. 4. 1. 1. 3) 的组的酶。
20.根据权利要求14至19中任一项的异源细胞，其中所述细胞来自选自Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Ustilago maydis, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Hansenula polymorha, Escherichia coli, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas stutzerii, Klebsiella pneumoniae, Deinococcus radiourans, Deinococcus geothermalis, Thermus thermophilus, Methanococcus maripaludis,Methanosarcina acetivorans,Methanospirilium hungatei 禾口 Methanocaldococcus jannashii 的组的生物。
21.根据权利要求13至19中任一项的异源细胞，其包含至少一种选自SEQID NO 149 ； SEQ ID NO 145,146,147,148 ；SEQ ID NO 167，168，169，170，171，172，173，174 ;SEQ ID NO 177,178,179,180,181,182,183,184 ；SEQ ID NO 224，226，236，238，248，250，260，262 ;SEQ ID NO 227,229, 239, 241, 251, 253, 263, 265 ；SEQ ID NO 194，196，206，208，221，223，281， 283 ；SEQ ID NO 188，190，200，202，215，217，272，274，SEQ ID NO 284，286 的组的任何序列所示的核酸序列。
22.根据权利要求14至21中任一项的异源细胞用于制备己内酰胺、6-氨基己酸、二氨基己烷或己二酸的用途。
23.用于制备聚合物的方法，所述方法包括使根据权利要求1至13中任一项所述方法制备的己二酸与具有至少两个能与己二酸的羧酸官能团反应的官能团的化合物反应，由此形成聚合物。
24.根据权利要求22的方法，其中所述能与己二酸的羧酸官能团反应的官能团选自胺基、羟基和异氰酸基。
25.用于制备己二酸酯的方法，包括使通过权利要求1至13中任一项所述方法制备的己二酸与醇反应。
全文摘要
本发明涉及用于制备己二酸的方法，其包括-将α-酮戊二酸(AKG)转化成α-酮己二酸(AKA)，-将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸(AKP)，-将α-酮庚二酸转化成5-甲酰基戊酸(5-FVA)，以及-将5-甲酰基戊酸转化成己二酸，其中这些转化中至少一种使用异源生物催化剂进行。本发明还涉及包含一种或多种异源核酸序列的异源细胞，所述核酸序列编码能催化所述方法中至少一个反应步骤的一种或多种异源酶。
文档编号C12P13/02GK102348805SQ201080011427
公开日2012年2月8日 申请日期2010年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽, 彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯, 斯蒂法恩·马莉亚·安德勒·德威尔德曼, 马丁·斯库尔曼 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司
文档序号 :
【 391892 】
技术研发人员：彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯,马丁·斯库尔曼,埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽,斯蒂法恩·马莉亚·安德勒·德威尔德曼
技术所有人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯,马丁·斯库尔曼,埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽,斯蒂法恩·马莉亚·安德勒·德威尔德曼
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