以大孔阴离子树脂固定化氨基酰化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种以大孔阴离子树脂固定化氨基酰化酶的方法。属于固定化氨基酰化酶的技术。
背景技术：
酶在常温常压下能高效地催化反应，并且具有很高的立体选择性和专一性。但酶作为一种蛋白质，稳定性较差，对热、强酸、强碱等均不稳定，即使在酶的最适反应条件下也往往会很快失活。并且，反应后游离酶与产品分离困难，产品容易造成蛋白质污染。为了充分利用酶的活性，克服上面提到的游离酶的各种缺点，通常将酶固定化后再用于生物反应。
尽管固定化酶在许多方面优于游离酶，但只有几种固定化酶在少数工业中作为主要催化剂得到应用，可见，在固定化方法和固定化酶的选择方面还有许多问题值得研究。通常，固定化方法主要有载体结合法，交联法和包埋法等三种。其中，载体结合法是固定化酶方法中最古老的一种，由于具有操作简单，条件温和，固定化酶的酶活回收率高等优点而仍广泛使用。目前，在氨基酸的拆分生产中使用效果较好的固定化酶是以DEAE-SephadexA-25为载体的固定化氨基酰化酶。但在国内，由于载体DEAE-SephadexA-25价格昂贵，使得国内的使用成本较高，并且该载体的流体力学性能及机械强度相对较差。由于大孔树脂具有较好的稳定性和机械强度，且价格便宜，易于活化，所以作为固定化载体受到了广泛的重视。
发明内容
本发明目的在于提供一种以大孔阴离子树脂固定化氨基酰化酶的方法。该方法过程简单，所制备的固定化氨基酰化酶具有价格低廉、性能稳定、比酶活和酶活回收率高优点。
本发明是通过下述方案加以实现的。一种以大孔阴离子树脂固定化氨基酰化酶的方法，其特征在于包括以下过程。
1.以大孔阴离子树脂DEAE-E/H、D380或D392为载体，载体在0.05mol.l-1-0.15mol.l-1浓度的醋酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液或硝酸溶液中经室温下处理，分别转型为Ac-、Cl-、放入30ml，0.1mol·L-1的醋酸钠溶液中，以100rpm的转速振荡0.5h，抽滤，最后用蒸馏水多次洗涤直至洗出液中无酶活性，抽滤干，即得固定化氨基酰化酶。
固定化酶酶活测定将上述制得的固定化酶按茚三酮显色法进行酶活测定，测得固定化酶比酶活为1350U·g-1，酶活回收率70.3％。
实施例二1.大孔阴离子树脂的转型将大孔阴离子树脂DEAE-E/H放在0.1mol.l-1的盐酸溶液中，经室温下处理转型为Ac-型树脂，转型后载体用去离子水充分洗涤，抽滤至干。
2.游离氨基酰化酶溶液的配制将氨基酰化酶用去离子水溶解，稀释至比酶活为140U.ml-1，用浓度为0.05mol·L-1NaOH溶液调节pH值至6.5。
3.固定化氨基酰化酶取1g步骤1处理转型得到Ac-型DEAE-E/H载体放入100ml锥形瓶中，加入步骤2配制的16ml游离氨基酰化酶溶液中，在25℃下，以150rpm的转速振荡5h，然后静置1h，抽滤。
按照实施例一的方法进行固定化酶的清洗和酶活测定，制备得到的固定化酶比酶活为1500U·g-1，酶活回收率67.0％。
实施例三1.大孔阴离子树脂的转型按照实施例二的方法将大孔阴离子树脂DEAE-E/H处理转型为Ac-型树脂。
2.游离氨基酰化酶溶液的配制将氨基酰化酶用去离子水溶解，稀释至比酶活为140U.ml-1，用浓度为0.05mol·L-1NaOH溶液调节pH值至5。
按照实施例一的方法进行酶的固定化、清洗和酶活测定，制备得到的固定化酶比酶活为900U·g-1，酶活回收率46.9％。SO42-或NO3-型载体。转型后载体用去离子水充分洗涤，备用。
2.将氨基酰化酶用去离子水溶解，稀释至比酶活为80-180U.ml-1，用NaOH溶液调节pH值至5-10。
3.将1g经步骤1转型的树脂加入到10-20ml经步骤2制备的游离酶溶液中，在20-45℃下，以100-200rpm的转速振荡3-5h后取出，静置抽滤；放入去离子水中继续振荡抽滤；然后用0.1mol.l-1的醋酸钠溶液浸泡，并以振荡0.5h，抽滤；最后用去离子水洗涤，直至洗出液中无酶活力，抽滤至干，得到固定化氨基酰化酶。
上述树脂的转型使用的酸溶液为醋酸溶液或盐酸溶液。
上述的游离酶溶液的比酶活为120-140U.ml-1。
上述的游离酶溶液的pH值为6-7。
上述的转型后大孔阴离子树脂与游离酶溶液的作用温度为25-35℃。
本发明所涉及的固定化条件温和，操作简单，固定化酶具有良好的机械性能和化学稳定性，价格低廉，不易受微生物侵袭，比酶活可达到1800U.ml-1，酶活回收率大于60％。此固定化氨基酰化酶可广泛用于氨基酸的拆分。
具体实施例方式
实施例一1.大孔阴离子树脂的转型将大孔阴离子树脂DEAE-E/H放在0.1mol.l-1的盐酸溶液中，经室温下处理转型为Cl-型树脂，转型后载体用去离子水充分洗涤，抽滤至干。
2.游离氨基酰化酶溶液的配制将氨基酰化酶用去离子水溶解，稀释至比酶活为120U.ml-1，用浓度为0.05mol·L-1NaOH溶液调节pH值至6.5。
3.固定化氨基酰化酶取1g步骤1处理转型得到Cl-型DEAE-E/H载体放入100ml锥形瓶中，加入步骤2配制的16ml游离氨基酰化酶溶液中，在25℃下，以150rpm的转速振荡5h，然后静置1h，抽滤。
4.固定化酶的清洗取步骤3制备的固定化酶，放入30ml蒸馏水，以150rpm的转速振荡1h，抽滤后，再实施例四1.大孔阴离子树脂的转型按照实施例二的方法将大孔阴离子树脂D380处理转型为Ac-型树脂。
2.游离氨基酰化酶溶液的配制按照实施例一的方法配制游离氨基酰化酶溶液。
按照实施例一的方法进行固定化酶的清洗和酶活测定，制备得到的固定化酶比酶活为1050U·g-1，酶活回收率54.7％。
实施例五操作条件与实施例一相同，改变游离酶溶液浓度为180U·ml-1，制备得到得固定化氨基酰化酶比酶活为1030U·g-1，酶活回收率35.7％。
实施例六操作条件与实施例一相同，改变游离酶溶液pH值为5，制备得到得固定化氨基酰化酶比酶活为650U·g-1，酶活回收率33.9％。
权利要求
1.一种以大孔阴离子树脂固定化氨基酰化酶的方法，其特征在于包括以下过程1).以大孔阴离子树脂DEAE-E/H、D380或D392为载体，载体在0.05mol.l-1-0.15mol.l-1浓度的醋酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液或硝酸溶液中经室温下处理，分别转型为Ac-、Cl-、SO42-或NO3-型载体，转型后载体用去离子水充分洗涤，备用；2).将氨基酰化酶用去离子水溶解，稀释至比酶活为80-180U.ml-1，用NaOH溶液调节pH值至5-10；3).将1g经步骤1转型的树脂加入到10-20ml经步骤2制备的游离酶溶液中，在20-45℃下，以100-200rpm的转速振荡3-5h后取出，静置抽滤；放入去离子水中继续振荡抽滤；然后用0.1mol.l-1的醋酸钠溶液浸泡，并以振荡0.5h，抽滤；最后用去离子水洗涤，直至洗出液中无酶活力，抽滤至干，得到固定化氨基酰化酶。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，树脂的转型使用的酸溶液为醋酸溶液或盐酸溶液。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，游离酶溶液的比酶活为120-140U.ml-1。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，游离酶溶液的pH值为6-7。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，转型后大孔阴离子树脂与游离酶溶液的作用温度为25-35℃。
全文摘要
本发明公开了一种以大孔阴离子树脂固定化氨基酰化酶的方法，属于固定化氨基酰化酶的技术。该方法包括以下过程，将以大孔阴离子树脂溶于0.05mol·l
文档编号C12N11/00GK1793353SQ20051001644
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月28日 优先权日2005年11月28日
发明者王燕, 朱怀工, 王淑兰, 张凤宝, 吴世梅 申请人:天津大学
文档序号 :
【 552186 】
技术研发人员：王燕,朱怀工,王淑兰,张凤宝,吴世梅
技术所有人：天津大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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