一种利用杀虫真菌降低烟粉虱体内植物病毒含量的方法与流程

一、技术领域

本发明属于病虫害防治技术领域，具体涉及一种利用杀虫真菌爪哇棒束孢降低烟粉虱体内植物病毒含量的方法。

二、技术背景

烟粉虱bemisiatabaci是一种世界性害虫，其刺吸作物造成直接为害，更大的为害是传播植物病毒，造成病毒病的大流行，给农业生产带来毁灭性灾害。番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)是烟粉虱传播的最重要植物病毒，属双生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)病毒，为单链环状dna病毒。烟粉虱的强入侵性造成了番茄黄化曲叶病毒病在亚洲、非洲、美洲等地区多个国家的流行，在我国大多数省份番茄黄化曲叶病毒病都有发生和流行，造成作物减产和农产品品质下降。

烟粉虱一旦获取番茄黄化曲叶病毒后，可在体内终身存留。如能有效降低烟粉虱体内番茄黄化曲叶病毒的存留，将可显著提高病毒病的控制效果。当前生产上对番茄黄化曲叶病的防控主要采取利用抗病虫品种、通过化学防治控制烟粉虱数量、用病毒拮抗剂等手段，尚未见如何杀虫微生物降低烟粉虱体内病毒含量以提高控病效果的研究报道。

爪哇棒束孢isariajavanica是一种重要昆虫病原真菌，可在叶蝉等刺吸类害虫种群中形成流行病，有效地控制害虫的为害，现已被开发为防假眼小绿叶蝉的生物杀虫剂。杀虫真菌侵染携带植物病毒的介体昆虫后，是否会对昆虫体内的植物病毒产生影响？国内外还未见研究报道。研究爪哇棒束孢对烟粉虱体内番茄黄化曲叶病毒的影响，期望能获得既能侵染害虫又能降低其体内植物病毒量的杀虫微生物，从而能同时实现害虫和病毒病的防治，更大程度地发挥杀虫微生物在植物病毒病防控方面的作用。

三、

技术实现要素：

1、发明目的

提供一种理想的降低昆虫介体中番茄黄化曲叶病毒含量的方法，能安全降低昆虫介体烟粉虱中番茄黄化曲叶病毒的含量，以更高效地控制番茄黄化曲叶病。

2、技术方案

本发明为一种降低烟粉虱中植物病毒含量的方法，其特征在于利用杀虫真菌爪哇棒束孢降低烟粉虱体内植物病毒含量的方法。

3、有益效果

本发明的方法与现有技术相比，产生以下有益效果：(1)与常规的杀虫微生物直接作用于害虫相比，本发明通过杀虫真菌爪哇棒束孢降低烟粉虱体内植物病毒含量，不仅可实现害虫的直接控制，还能对植物病毒具有控制作用；(2)与化学药剂防治害虫及控制病毒病相比，本发明利用杀虫真菌降低植物病毒量，可切实提高病毒病控制的无公害控制水平，有效减少环境污染。

四、具体实施方式

本发明的实施例是采用室内测定的方法。

测定方法如下：

1、烟粉虱与杀虫真菌爪哇棒束孢

带毒高龄若虫：挑选番茄黄化曲叶病发病明显的番茄植株上，烟粉虱高龄若虫密度大并且叶片长势较为整齐的叶片，用于杀虫真菌处理。

带毒刚羽化成虫：采集密度和长势较为一致的带烟粉虱高龄若虫(10日龄左右若虫，羽化前4天若虫为宜)且番茄黄化曲叶病发病明显的叶片，放在一次性杯中，每天观察烟粉虱羽化情况，将同一天羽化成虫收集在一起用于试验。

爪哇棒束孢：将实验室保存的爪哇棒束孢孢子粉配制成2×10⁵孢子/ml和2×10⁶孢子/ml两个浓度悬浮液，对烟粉虱若虫和成虫两个虫态均进行处理。每处理重复5次，若虫处理每重复50头以上若虫，成虫处理每重复30头成虫。

2、爪哇棒束孢处理烟粉虱

若虫处理采用浸叶法：直接将带高龄若虫(10日龄左右若虫，羽化前4天若虫为宜)叶片在孢子悬浮液中浸10秒钟取出，晾干后放在适合容器中，同时以清水作为空白对照。待成虫羽化后，将刚羽化成虫用于病毒检测。

成虫处理采用喷雾法：将刚羽化成虫接入带苗一次性杯中，用孢子液喷雾处理成虫和叶片。同时以清水作为空白对照。处理后4天的烟粉虱用于病毒检测。

3、烟粉虱dna的提取

各处理每重复均随机10头烟粉虱进行群体dna提取。在1.5ml的离心管中加入10头烟粉虱和20μl的dna碱裂解液(50mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/lnacl，1mmol/ledta，1％sds)，充分研磨。加1μl蛋白酶k(20mg/ml)，离心30秒，60℃水浴1小时，追加1μl蛋白酶k，离心30s，继续水浴2小时，加178μl的双蒸水，100℃水浴5min，灭活蛋白酶k。取100μl提取液于另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，4℃冰箱沉淀过夜后4℃13000rpm离心10分钟，倒出乙醇，晾干后加20μl的双蒸水溶解dna，-20℃保存。

4、番茄植株中番茄黄化曲叶病毒的定量检测

番茄黄化曲叶病毒基因组1462(+)至1601(-)片段的拷贝数通过abistepone荧光定量pcr仪来测定，用于扩增番茄黄化曲叶病毒基因组1462(+)至1601(-)片段的引物为：

(yg3)5’-gagttcccctgtgcgtgaa-3’

(yg5)5’-ctgttcgcaagtatcaatcaaggt-3’

反应体系为：premixextaq(tlirnasehplus)(takara)，引物各0.6μl，referencedyeii0.4μl，dna1μl和ddh2o7.4μl。

扩增程序：52℃2min，95℃1min，40个循环：95℃r5s，60℃30s，72℃。

5、数据分析

用统计分析软件spss17.0对若虫期和成虫期各处理烟粉虱番茄黄化曲叶病毒含量均采用单因素方差分析和turkey多重比较法进行各处理间的差异显著性分析。

五、实施效果：

1、烟粉虱若虫感染爪哇棒束孢对体内番茄黄化曲叶病毒含量的影响

用2种浓度爪哇棒束孢悬浮液处理烟粉虱高龄若虫，检测处理4d后害虫体内番茄黄化曲叶病毒含量，发现爪哇棒束孢侵染显著降低了烟粉虱若虫体内番茄黄化曲叶病毒含量，清水对照组烟粉虱若虫体内番茄黄化曲叶病毒含量分别是2×10⁵孢子/ml处理组和2×10⁶孢子/ml处理组tylcv含量的3.27倍和4.97倍(f＝43.867，df＝2，44，p＜0.001)，表明杀虫真菌爪哇棒束孢处理烟粉虱若虫有效降低了害虫体内番茄黄化曲叶病毒的含量。

2、烟粉虱成虫感染爪哇棒束孢对体内番茄黄化曲叶病毒含量的影响

同样发现爪哇棒束孢侵染显著降低了烟粉虱成虫体内番茄黄化曲叶病毒的含量，清水对照组烟粉虱成虫体内番茄黄化曲叶病毒含量分别是2×10⁵孢子/ml处理组和2×10⁶孢子/ml处理组成虫体内番茄黄化曲叶病毒含量的12.13倍和186.47倍(f＝9.125，df＝2，44，p＝0.001)，表明杀虫真菌爪哇棒束孢处理烟粉虱成虫也有效降低了害虫体内番茄黄化曲叶病毒的含量。