水毒性检测中发光细菌荧光行为的规范和数值解析的制作方法
【专利摘要】尽管发光细菌接触毒物能够很好的量化毒性，可是由于生物多样性，其毒性量化数值非常难用于科学交流，无法用于实际水环境检测和监测。本发明极大提高了发光细菌用于毒理检测的可重现性，如果检测所使用同一种标准毒素和发光细菌剂型，试验结果误差小于10％。比如，使用冻干特定费氏弧菌(Aliivibrio?Fischeri)株来检测苯酚(分析纯)的毒性，其毒性检测结果具有极高的可重现性，不因操作人员或者地域变化而改变，试验结果误差小于10％。完全可以被用作水体毒性的评估，其结果可以用于科学交流。通过对发光细菌长期的实验室观察和重复试验，总结出了一套大大提高发光细菌用于毒理检测的可重现性的方法，主要包括以下两项发明：1)“发光细菌荧光行为规范”的办法；2)在数值解析上改进来降低误差。
【专利说明】水毒性检测中发光细菌荧光行为的规范和数值解析
[0001]水毒性检测中发光细菌荧光行为的规范和数值解析
1.【技术领域】
[0002]本发明可以给任意未知水溶性毒素的生态毒性(ecotoxicity)在短时间(一个小时)内定量，这些毒素包括无机盐，有机化合物以及含有色彩的水；可以在没有任何分析化学知识背景的情况下对水的毒性作出预警。简单的说，不知道，也不关心是什么水溶物质，但是想知道毒性到底有多大？生物(生态)后果是什么？
[0003]本发明不适用于化学物质致癌性或者病原体危险的评估和判断；也不适合真核细胞受体的毒性反应判断，也称药理毒理。
[0004]本发明可能具有潜在误导性，比如酒精在本检测中结果为有毒，而实际酒精在环境中并无直接伤害，这是归因酒精具有蛋白变性功能，也对人体器官有毒。
2.【背景技术】
[0005]水体环境的有毒污染源可以是多方面的，比如工业废水的排放含有毒性，工业或者交通事故造成化学物质河流污染，甚至污水本身没有毒性，可是由于生物降解过程中破坏有机化合物的分子极性使得污水进入环境中后毒性陡增。这些情况下，很难短期内对污水的化学性质仔细分析，要求对给定污水样本的没有任何分析化学知识的情况下对水的毒性作出判断，而这些判断将直接指导行动。这个过程，时间珍贵。
[0006]在过去的水体毒性评估中，曾经使用彩虹鳟鱼(Oncorhynchus mikiss)或者水跳蚤(Daphnia magna)在水中的死亡率来量化水的毒性。可是彩虹鳟鱼和水跳蚤的活性标准非常难以界定，而商业化的标准的水生动物是非常的昂贵，无法在实际中使用。
[0007]发光细菌或者突光细菌(bioluminescentbacteria或者 luminescent bacteria)的发光行为和其呼吸链化学反应紧密相关。当发光细菌接触有毒物质后，有毒物质破坏了发光细菌的生理代谢，从而发光的强度衰减。发光细菌的发光强度表达为“相对荧光单位”(Relative Luminescent Unit, RLU)的衰减值来对毒性评估和量化。
[0008]利用发光细菌接触毒物来量化毒性是一项非常迷人的技术，它可以在很短的时间内给出毒性量化数据。多年实验室研究及国内外文献证实细菌的发光细菌荧光行为(bioluminescent behavior)是一个极其多变的行为,有着极为复杂的生物多样性，比如同一批培养的发光细菌的RLU值可以是几十倍甚至上百倍的差别，可以用喜怒无常来形容细菌发光行为。
[0009]另外由于相对突光单位RLU没有一个统一的国际标准,不同厂家生产的发光检测仪(Luminometer)使用了各异的光电倍增管(photomultiplier)和信号放大电路,从而即使发光强度一致，不同厂家的发光检测仪的RLU读数也是千差万别。
[0010]尽管发光细菌接触毒物能够很好的量化毒性，可是由于RLU的可重现性极低，其毒性量化数值和单位结果非常难用于科学交流，从而准确性和可重现性大打折扣。无法用于实际水环境检测和监测。[0011]目前自然界挑选的发光细菌都是兼性嗜冷菌(psychrotrophic bacterium),通常生活在10° -20°C;从生态分部来看分为海洋细菌(费氏弧菌株Aliivibrio fischeri)和淡水细菌(青海弧菌vibrio Qinghaiensis)。这些发光细菌都已经被用于水毒性检测。
[0012]目前没有文献记载怎样规范这些发光细菌的荧光行为从而得到一个可以信奈的毒性检测数据。
3.
【发明内容】
[0013]本发明极大提高了发光细菌用于毒理检测的数据可重现性，如果检测所使用同一种标准毒素和发光细菌剂型，试验结果通常误差小于10%。比如，使用冻干特定费氏弧菌株(Aliivibrio fischeri ATCC700601)来检测苯酚(分析纯)的毒性，其毒性检测结果具有极高的可重现性，不因操作人员或者地域变化而改变，试验结果误差小于10%。完全可以被用作水体毒性的评估，其结果可以用于科学交流。
[0014]—,发光细菌突光行为规范的方法
[0015]本发明对比了两组不同类别的细菌:海洋细菌(费氏弧菌株AliivibrioFischeri)和淡水细菌(青海弧菌Vibrio qinghaiensis)。通过对两组细菌的突光行为观察，归纳总结出了一套规范“发光细菌荧光行为”的办法。
[0016]这些办法包括严格控制细胞培养，收获，保藏和检测时的环境和过程。过程中具体控制细菌的年龄，群体效应(Quorum sensing)，生理状态，细胞密度。在检测过程中，严格控制液体氧气浓度，孵化时间和温度来规范细菌的发光行为。
[0017]二，放光细菌荧光行为的数值解析
[0018]使用修正因子来修正对照样本读数，降低由于生物多样性引起的误差；
[0019]建立样本浓度，时间和毒物伽马值的线性关系。对于有色污水，采用色彩纠正的办法来去除光学干扰引起的误差。
[0020]三，对比海洋发光细菌(费氏弧菌株Aliivibrio Fischeri)和淡水发光细菌(青海弧菌vibrio Qinghaiensis)的发光行为后,总结出本方法的适用性。
[0021]四，检测不同厂家生产的发光检测仪(Luminometer)。
[0022]在发光细菌荧光行为数值中，采用了比值方式，取消所有不同生产厂家发光仪器检测仪的任意差别。具体的说把荧光抑制效果等于零时间点的荧光强度减去某一接触时间的荧光强度(得出衰减的荧光强度)在除以零时间点的荧光强度。通过这样的方式，将仪器间的不同度数全部统一起来。
【具体实施方式】
[0023]菌种极其配套培养基和试剂
[0024]1.海洋发光细菌费氏弧菌(Aliivibrio fischeri ATCC700601)
[0025]由美国菌种保藏中心购得(AmericanType Culture Collection)
[0026]培养基:每I升培养基含有:5克酵母膏，5克胰胨，0.5克硫酸镁，I克碳酸钙，3克磷酸氢钾，30克氯化钠，如有必要琼脂培养基另加20克琼脂。121°高压蒸汽灭菌后常温保存。
[0027]冰冻保护液:每100毫升冰冻培养液含有:60克葡萄糖，4克氯化钠，2克L-组氨酸，0.5克牛血清蛋白，充分溶解后调整PH值为7备用。
[0028]冻干保护液:每100毫升冻干液含有:8克脱脂奶粉，8克葡萄糖，0.5克精氨酸和3克氯化钠，充分溶解后调整PH值为7备用。
[0029]细菌复活及检测缓冲液:每100亳升缓冲液含有:7.3克葡萄糖，2.3克6水氯化续，0.3 克氯化钾，12 克 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-(2-ethanesulfonicacid), Sigma公司.)20克氯化钠；pH调至7.0。
[0030]2.淡水发光细菌:青海弧菌 vibrio Qinghaiensis CS235
[0031]由北京滨松光子学商贸(中国)有限公司购得
[0032]培养基:每I升培养基含有2.5克硫酸镁，0.5克碳酸镁，0.5克碳酸钙，0.15克氯化钾，8克氯化钠，5克酵母膏，5克胰胨，如有必要琼脂培养基另加20克琼脂。121。高压蒸汽灭菌后常温保存。
[0033]冰冻保护液:每100毫升冰冻培养液含有:60克葡萄糖，0.8克氯化钠，2克L-组氨酸，0.5克牛血清蛋白。充分溶解后调整PH值为7备用。
[0034]冻干保护液:每100亳升冻干液含有:8克脱脂奶粉，8克葡萄糖，0.5克精氨酸，充分溶解后调整PH值为7备用。
[0035]细菌复活及检测缓冲液:每100毫升缓冲液含有:7.3克葡萄糖，23克6水氯化续，0.3 克氯化钾，12 克 HEPES(N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N-(2-ethanesulfonicacid), Sigma公司.) 3克氯化钠；pH调至7.0。
[0036]试骀操作步骤
[0037]一种利用发光细菌接触水溶性毒物后对毒物毒性进行量化的方法进行标准化操作。使标准毒物的检测毒性小于10%。有效规范细菌的荧光行为达到标准化目的；
[0038]I)发光细菌的培养和收获:
[0039]第一步:单菌落发光细菌被接种在一个10毫升的无菌液体培养基液锥形瓶(容量50毫升)中，摇床180转每分钟，保温20°C，培养24小时后取I毫升菌液进行二次接种；
[0040]第二步:1毫升放光菌液被再次接种到50毫升的无菌液体培养基锥形瓶(容量250毫升)中，摇床180转每分钟，保温20°C，培养20小时后检测细胞密度达标后(0D600=0.8-1.0)立刻将菌液放在冰沙上冰浴15分钟；
[0041]第三步:将冰浴后菌液进行4°C冷冻离心(6000g) 15分钟后去除上清液收获细胞。
[0042]2)收获的细菌保存:
[0043]?冰冻保存:将收获细胞在100毫升冰冻保存液(冰浴中预冷15分钟)中冰浴15分钟搅匀，100微升分装，放入液氮中凝固I分钟，放入-70°C冰箱保存2年直至使用；
[0044]?冷冻干燥保存:将收获细胞在100毫升冷冻干燥液(冰浴中预冷15分钟)中冰浴15分钟搅匀，100微升分装，放入液氮中凝固I分钟，放入冷冻干燥机干燥后，常温暗室保存2年直至使用。
[0045]3)细菌的复活与测试菌液制备
[0046]将一份冰冻保存或者冷冻干燥的发光细菌溶解在100毫升复活液中，溶解时将试管轻轻摇晃，避免产生气泡。将完全溶解的细胞放在20°C铝锭温控上静静孵化15分钟-30分钟。制备完毕
[0047]4)测试有毒污水制备[0048]将污水以任意比例连续稀释10次(通常建议10% )，如果使用海洋发光细菌检测的样本将最终氯化钠浓度控制在2%。最后将有毒污水放在15°C铝锭温控上静静孵化15分钟。
[0049]5)毒性检测读数
[0050]将有毒污水以同容量比例加入先前制备的发光细菌溶液中，记录接触后记录零时间，5分钟，15分钟和30分钟的光强(RLU)值。使用不同厂家生产的发光检测仪(Luminometer)包括:CleanTrace (3M公司),滨松BHP9514型饮用水检测仪(北京滨松光子有限公司)。全部过程在15°C铝锭温控上控温。 [0051]数据解析:
[0052]为了减小生物多样性引起的误差，首先引入荧光强度纠正因子，如公式I描述，一个对照组细菌，在没有任何毒物接触的情况下，有时荧光强度也会衰减，其衰减的比例称为荧光强度纠正因子:
[0053]公式1:荧光强度的纠正因子:
[0054]fkt = Ikt/10
[0055]fkt接触T时间的纠正因子(时间通常记录为分钟)
[0056]10接触零时间的荧光强度(在对照组中的样本，单位为RLU)
[0057]Ikt接触T时间的荧光强度(在对照组中的样本，单位为RLU)
[0058]在毒物检测样本中，其荧光发光强度与纠正因子之积为纠正后的荧光强度。如公式2:
[0059]公式2:纠正后的荧光强度
[0060]Ict = 10fkt
[0061]fkt是fkt的平均数；
[0062]I。是接触零时间的荧光强度(RLU)
[0063]Ict 纠正后的 Itl(RLU)
[0064]细菌在接触毒物T时间后，其荧光强度已经衰减了，其荧光抑制效果表达为公式3:
[0065]公式3:(细菌的)荧光抑制效果
[0066]Ht = (Ict-1n)/Ict X 100
[0067]Ht是一个给定样本在固定接触时间内的荧光抑制效果(以百分比表示)
[0068]Ict纠正后的10;
[0069]Ilt是一个给定样本在固定接触时间内的荧光强度(RLU)
[0070]为了评估浓度和毒性的关系，引入伽马值来描述某一特定时间下每一个稀释浓度的抑制效果。
[0071]公式4:毒性物质的伽马值
[0072]rt = Ht/(IOO-Ht)
[0073] tis测定样本接触时间后的伽马值
[0074]Ht是一个给定样本在固定接触时间内的荧光抑制效果(以百分比表示)
[0075]用毒物浓度，以及某固定接触时间的伽马值(毒物本身的毒理特性)建立一个线性关系如公式5:[0076]公式5:在给定接触时间下毒性和浓度的关系
[0077]Igc = big gamma t+lga
[0078]gamma t测定样本接触时间后的伽马值；
[0079]Ct测试样本的稀释比例(通常以百分比表示)；
[0080]比如gamma t = 0.25,那么 Ct = IC2。,或者比如 gamma t = I,那么 Ct = IC50 ；
[0081]gamma t是测定样本接触时间后的伽马值；
[0082]b:斜率
[0083]抑制浓度(Inhibition Concentration, IC)用来表达一个给定污水样本的浓度抑制细菌发光的比例。比如IC2tl表示某浓度的污水在一个接触时间内抑制了 20%的细菌最大发光强，或者IC5tl表示某浓度的污水在一个接触时间内抑制了 50%的细菌最大发光强。IC值越小表示污水毒性越大。而接触时间越短(比如5分钟)就显示出毒性是急性毒性。
[0084]色差纠正:
[0085]发光细菌通常发光波长在490纳米(黄绿色)，然而一些检测样本可能含有颜色可能带来干扰，所以有必要在毒性测试以前进行色差纠正。
[0086]使用分光光度 仪(上海奥析科学仪器有限公司AX6001)将污水读取490纳米的吸收值(对比对照组用去离子水):
[0087]公式6:490纳米吸收贡献值
[0088]Ax = 2.303 X ABSx
[0089]ABSx是490纳米吸收值
[0090]Ax是490纳米吸收贡献值
[0091]公式7:色彩透射比(Transmittance)
[0092]Tx=(l-e’/Ax
[0093]Tx是透射比
[0094]Ax是490纳米吸收贡献值
[0095]公式8:色彩纠正后的发光强度
[0096]AC10 = 10XTx
[0097]ACItl是色彩纠正后的发光强度
[0098]10是接触零时间的荧光强度(RLU，如公式2描述)
[0099]Tx是透射比
[0100]对于色彩纠正后的毒性检测，由公式8数值ACItl取代公式Itl, ACIlt取代In继续运算。
[0101]常见有毒物的半数抑制浓度(IC50)
[0102]无机物样品冻干海洋与淡水发光细菌半数抑制浓度(IC50)
[0103]
【权利要求】
1.在毒性检测中发光细菌荧光行为规范的方法 a)细菌的复活与测试菌液制备 将一份冰冻保存或者冷冻干燥的发光细菌溶解复活液过程中，需要将细菌完全溶解后放在15-25 °C铝锭温控上静静孵化15分钟-45分钟。 b)测试有毒污水制备 将污水以任意比例连续稀释后必须将污水放在10-20°C铝锭温控上静静孵化10-25分钟。 c)毒性检测读数 将有毒污水以同容量比例加入制备的发光细菌溶液中，记录接触后记录各时间点(比如零时间，5分钟，15分钟和30分钟)的光强(Relative Luminescent Unit)值。
2.全部发光细菌检测温控过程中，15-25°C或者10-20°C，铝锭温控最为便捷。
3.数值解析 为了减小生物多样性引起的误差，首先引入荧光强度纠正因子，如公式I描述，一个对照组细菌，在没有任何毒物接触的情况下，有时荧光强度也会衰减，其衰减的比例称为荧光强度纠正因子: 公式1:荧光强度的纠正因子:
fkt = Ikt/1 fkt接触T时间的纠正因子(时间通常记录为分钟) 10接触零时间的荧光强度(在对照组中的样本，单位为RLU) Ikt接触T时间的荧光强度(在对照组中的样本，单位为RLU) 在毒物检测样本中，其荧光发光强度与纠正因子之积为纠正后的荧光强度。如公式2: 公式2:纠正后的荧光强度 Ict=Iofkt fkt是fkt的平均数； Itl是接触零时间的荧光强度(RLU) Ict纠正后的Iq(RLU) 细菌在接触毒物T时间后，其荧光强度已经衰减了，其荧光抑制效果表达为公式3: 公式3:(细菌的)荧光抑制效果 Ht= (Ict-1n)/Ict X 100 Ht是一个给定样本在固定接触时间内的荧光抑制效果(以百分比表示) Ict纠正后的I。； Ilt是一个给定样本在固定接触时间内的荧光强度(RLU) 为了评估浓度和毒性的关系，引入伽马值来描述某一特定时间下每一个稀释浓度的抑制 效果如公式4: 公式4:毒性物质的伽马值 rt = Ht/(IOO-Ht) Ft is测定样本接触时间后的伽马值 Ht是一个给定样本在固定接触时间内的荧光抑制效果(以百分比表示)用毒物浓度，以及某固定接触时间的伽马值(毒物本身的毒理特性)建立一个线性关系 如公式5: 公式5:在给定接触时间下毒性和浓度的关系 Igc = big r t+lga r t测定样本接触时间后的伽马值； Ct测试样本的稀释比例(通常以百分比表示)； 比如rt = 0.25，那么Ct = IC20，或者比如rt = 1，那么Ct = IC50 ； r t是测定样本接触时间后的伽马值； b:斜率 抑制浓度(Inhibition Concentration, IC)用来表达一个给定污水样本的浓度抑制细菌发光的比例。比如IC2tl表示某浓度的污水在一个接触时间内抑制了 20%的细菌最大发光强，或者IC5tl表示某浓度的污水在一个接触时间内抑制了 50%的细菌最大发光强。IC值越小表示污水毒性越大。而接触时间越短(比如5分钟)就显示出毒性是急性毒性。
4.色差纠正: 发光细菌通常发光波长在490纳米(黄绿色)，然而一些检测样本可能含有颜色可能带来干扰，所以有必要在毒性测试以前进行色差纠正。 使用分光光度仪将污水读取490纳米的吸收值(对比对照组用去离子水): 公式6:490纳米吸收贡献值
Ax = 2.303 X ABSx ABSx是490纳米吸收值 Ax是490纳米吸收贡献值 公式7:色彩透射比(Transmittance)
Tx = (l-e_Ax)/Ax
Tx是透射比 Ax是490纳米吸收贡献值 公式8:色彩纠正后的发光强度(Itl为例) AC10= 10XTx ACItl是色彩纠正后的发光强度。
5.对比海洋发光细菌(费氏弧菌株AliivibrioFischeri)和淡水发光细菌(青海弧菌vibrio Qinghaiensis)的发光行为后,总结出本方法适用于淡水和海洋发光细菌的毒性检测。
6.检测不同厂家生产的发光检测仪(Luminometer)。 在发光细菌荧光行为数值中，采用了比值方式，取消所有不同生产厂家发光仪器检测仪的任意差别。具体的说把荧光抑制效果等于零时间点的荧光强度减去某一接触时间的荧光强度(得出衰减的荧光强度)在除以零时间点的荧光强度。通过这样的方式，将仪器间的不同度数全部统一起来。 不同厂家生产的发光检测仪(Luminometer)使用了各异的光电倍增管(photomultiplier)放大电路，RLU差别很大,但是毒性效果一致。
【文档编号】G01N21/64GK103940789SQ201310017439
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月17日 优先权日:2013年1月17日
【发明者】刘星海 申请人:刘星海
文档序号 :
【 6167996 】
技术研发人员：刘星海
技术所有人：刘星海
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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