乙肝患者t细胞免疫状态检测方法
技术领域：
本发明涉及一种乙肝患者T细胞免疫状态检测方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球性问题，单独在我国即有超出一亿以上的人口是乙肝病毒的长期携带者。病毒的长期携带者，尤其是“大三阳”(表面抗原阳性、e抗原阳性、核心抗体阳性)的患者；最终会导致肝硬化和肝癌。因此，治疗乙型肝炎是一项重要的、刻不容缓的工作。遗憾的是，人类至今没有找到一项根治乙肝病毒的有效方法。近几年的研究发现，机体对病毒的反应与其自身的免疫状态是密切相关的。当患者的免疫系统中的T细胞处于对乙肝病毒的激活状态时，机体在药物的配合下，就会产生对病毒的抑制，并最终有利于病毒的清除。反之，当患者免疫系统中的T细胞对乙肝病毒不识别时；药物的作用不会起到清除病毒的作用。由此来看，建立一种检测乙肝患者的T细胞免疫状态的方法，就可以帮助医生对患者进行个体差别的治疗，提高治疗效果；因此，是一件重要的工作。
免疫系统的细胞功能检测，一直是生物学技术的一个难点。近年来，酶联免疫斑点实验(ELISPOT)的采用，克服了这一难点。酶联免疫斑点实验具有极高的灵敏度，在十万个免疫细胞中，只要有一个激活态的细胞，即可检测出来。同时，操作简单、结果稳定性好、以及可以高通量的检测等。由于具有这些明显的优点，使得酶联免疫斑点实验(ELISPOT)成为了检测免疫细胞功能的公认的实验方法。
ELISPOT在乙型肝炎的研究方面，已经有的研究，都是使用重组的乙型肝炎相关蛋白，作为特异性抗原的刺激剂，来检测特异性的T细胞功能。这项工作已见相关的文献报道。使用重组的蛋白，存在着很多的实验上的缺点，主要有以下几点1.不同来源的重组蛋白的生物学活性有很大的差异；因此，很难作为一个常规的、标准化的检测项目得到应用。
2.无论如何纯化，重组蛋白都带有宿主的蛋白。而宿主蛋白对免疫细胞往往非特异的激活，如大肠杆菌的毒素蛋白，本身就是免疫系统的泛激活剂。这样建立的实验方法，特异性较差，并且实验本底较高。
3.重组蛋白的稳定性较差，易于失活，一般需要负20度以下保存。即使是进行了冻干保存，使用也需要重新溶解，不能反复使用。这样，实验条件的一致性就不能保证。
发明内容
本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种乙肝患者T细胞免疫状态检测方法，减少检测的背景值，提高特异性。
为实现上述目的，本发明提出一种乙肝患者T细胞免疫状态检测方法，其特征是包括如下步骤(1)使用下述多肽中的一种或二种的组合或三种的组合在体外培养乙肝患者外周血淋巴细胞中进行刺激多肽一即乙肝病毒核心抗原的129-140位氨基酸PPAYRPPNAPIL，其氨基酸序列为Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro IleLeu；多肽二即核心抗原的18-27位氨基酸FLPSDFFPSV，其氨基酸序列为Phe LeuPro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val；多肽三乙肝病毒核心抗原多肽EYLVSFGVW，其氨基酸序列为Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp；(2)利用酶联免疫斑点实验方法，检测经上述刺激后分泌人γ干扰素的淋巴细胞数的多少，从而确定乙肝患者的T细胞免疫激活状态。
由于合成多肽不含有重组蛋白中的宿主杂蛋白，不存在非特性激活免疫细胞的作用；实验的特异性得到了大大的提高。正常对照组中，几乎没有非特异性的斑点。合成多肽的批间的生物学活性的稳定性大大地提高，实验结果的批间差异大大地缩小。合成多肽可以在4度条件下，保存六个月，活性没有明显地减少。大大的有利于试剂盒的使用。
具体实施例方式本方法是基于ELISPOT的检测方法，它对于ELISPOT主要有以下条件要求1.选择活性高、特异性好的抗人γ干扰素的包被单克隆抗体。该抗体包被后应可以在4度下，活性保存一年以上。
2.选择活性高、特异性好的抗人γ干扰素的第二单克隆抗体。该抗体应与包被用的单克隆抗体针对不同的抗原位点，在与抗原结合上，不会产生位阻效应。该抗体与生物素通过共价键连接后，具有较高的活性，并可以在4度下保存一年以上。
3.采用商品化的96孔高吸附性的细胞培养板和亲和素-辣根过氧化物复合物。其它实验室试剂均须是分析纯级。
4.乙肝病毒核心抗原多肽合成采用多肽合成仪合成以下三种多肽(1)乙肝病毒核心抗原多肽1序列即核心抗原的129-140位氨基酸(PPAYRPPNAPIL)脯氨酸(P)-脯氨酸(P)-丙氨酸(A)-酪氨酸(Y)-精氨酸(R)-脯氨酸(P)-脯氨酸(P)-天冬酰胺(N)-丙氨酸(A)-脯氨酸(P)-异亮氨酸(I)-亮氨酸(L)。序列号Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu。
(2)乙肝病毒核心抗原多肽2序列即核心抗原的18-27位氨基酸(FLPSDFFPSV)苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-脯氨酸(P)-丝氨酸(S)-天冬氨酸(D)-苯丙氨酸(F)-苯丙氨酸(F)-脯氨酸(P)-丝氨酸(S)-缬氨酸(V)。序列号Phe LeuPro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val。
(3)乙肝病毒核心抗原多肽3序列EYLVSFGVW谷氨酸(E)-酪氨酸(Y)-亮氨酸(L)-缬氨酸(V)-丝氨酸(S)-苯丙氨酸(F)-甘氨酸(G)-缬氨酸(V)-色氨酸(W)。序列号Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp。
其检测方法包括如下步骤1.在高吸附的培养板上包被抗人γ干扰素的包被单克隆抗体，4度过夜后将液体去掉。
2.分离人外周血淋巴细胞(PBMC)，加入已包被抗体的培养板中。每孔细胞数应在104至106之间。
3.单独加入多肽1，或多肽2，或多肽3，或将三种多肽混合后，加入培养板。每孔的终浓度应在1-20微克/毫升。
4.在37度，二氧化碳的浓度为5％，湿度为大于98％的条件下，进行细胞培养20小时。
5.去掉细胞，加入与生物素共价结合的抗人γ干扰素的第二单克隆抗体，室温1-3小时。
6.去掉抗体，加入亲和素-辣根过氧化物复合物，室温1-2小时。
7.去掉酶复合物，加入酶底物AEC(Sigma，Cat.No.A-5754)。室温显色20-30分钟。
8.用水洗掉酶底物溶液，使用自动仪器，或是采用在显微镜下目测方法来计数。
9.结果分析每一个斑点代表一个分泌人γ干扰素的淋巴细胞。
为了说明使用合成乙肝病毒核心多肽激活与使用重组乙肝病毒核心抗原激活机体免疫细胞的优点，特设计了以下试验
1.选择阴性对照、阳性对照各10个样品。阴性对照为乙肝病毒未感染者(五项免疫指标中只有抗表面抗体一项阳性，或全部阴性)。阳性对照为乙肝病毒感染者(抗核心抗体阳性)。
2.合成多肽委托国外公司合成，纯度大于97％；重组乙肝病毒核心抗原从国内有关单位购买，纯度大于95％。
3.实验数据统计 4.结果说明根据上述实验结果，可以看出，在阳性样品的斑点检出数方面，无论是何种序列的多肽，还是全序列的重组核心抗原，都没有显著的差异(p＞0.05)。而在阴性标本中，合成多肽之间没有显著性差异(p＞0.05)；但是在合成多肽与重组核心抗原之间，存在着明显的差异性(p＜0.01)。因此说明，合成多肽作为机体免疫细胞的外在的刺激剂时，可以减少检测的背景值，提高特异性。
权利要求
1.一种乙肝患者T细胞免疫状态检测方法，其特征是包括如下步骤(1)使用下述多肽中的一种或二种的组合或三种的组合在体外培养乙肝患者外周血淋巴细胞中进行刺激多肽一即乙肝病毒核心抗原的129-140位氨基酸PPAYRPPNAPIL，其氨基酸序列为Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu；多肽二即核心抗原的18-27位氨基酸FLPSDFFPSV，其氨基酸序列为Phe LeuPro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val；多肽三乙肝病毒核心抗原多肽EYLVSFGVW，其氨基酸序列为Glu Tyr Leu ValSer Phe Gly Val Trp；(2)利用酶联免疫斑点实验方法，检测经上述刺激后分泌人γ干扰素的淋巴细胞数的多少，从而确定乙肝患者的T细胞免疫激活状态。
2.如权利要求1所述的乙肝患者T细胞免疫状态检测方法，其特征是使用所述多肽或其组合在体外培养乙肝患者外周血淋巴细胞中进行刺激的方法包括如下步骤(1-1)在高吸附的培养板上包被抗人γ干扰素的包被单克隆抗体，4度过夜后将液体去掉；(1-2)分离人外周血淋巴细胞PBMC，加入已包被抗体的培养板中；每孔细胞数应在104至106之间；(1-3)单独加入所述多肽一、或多肽二、或多肽三，或将三种多肽混合后，加入培养板；每孔的终浓度应在1-20微克/毫升；(1-4)在37度，二氧化碳的浓度为5％，湿度为大于98％的条件下，进行细胞培养20小时。
3.如权利要求1或2所述的乙肝患者T细胞免疫状态检测方法，其特征是所述酶联免疫斑点实验方法包括如下步骤(2-1)去掉细胞，加入与生物素共价结合的抗人γ干扰素的第二单克隆抗体，室温1-3小时；(2-2)去掉抗体，加入亲和素-辣根过氧化物复合物，室温1-2小时；(2-3)去掉酶复合物，加入酶底物AEC(Sigma，Cat.No.A-5754)。室温显色20-30分钟；(2-4)用水洗掉酶底物溶液，使用自动仪器，或是采用在显微镜下目测方法来计数；(2-5)结果分析每一个斑点代表一个分泌人γ干扰素的淋巴细胞，也就是代表处于激活状态的T细胞。
全文摘要
本发明公开一种乙肝患者T细胞免疫状态检测方法，使用人工合成的多肽在体外培养乙肝患者外周血淋巴细胞中进行刺激，利用酶联免疫斑点实验方法，检测经上述刺激后分泌人γ干扰素的淋巴细胞数的多少，从而确定乙肝患者的T细胞免疫激活状态。由于合成多肽不含有重组蛋白中的宿主杂蛋白，不存在非特性激活免疫细胞的作用；实验的特异性得到了大大的提高。正常对照组中，几乎没有非特异性的斑点。合成多肽的批间的生物学活性的稳定性大大地提高，实验结果的批间差异大大地缩小。合成多肽可以在4度条件下，保存六个月，活性没有明显地减少。大大的有利于试剂盒的使用。
文档编号G01N33/543GK1570641SQ200410022540
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者吴庆军 申请人:深圳市达科为生物技术有限公司
文档序号 :
【 5844843 】
技术研发人员：吴庆军
技术所有人：深圳市达科为生物技术有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：吴庆军
技术所有人：深圳市达科为生物技术有限公司
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