一种液液萃取-gfaas法测定一价铜含量的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于微量元素检测技术领域，具体地，设及一种液液萃取-GFAAS法测定一 价铜含量的方法。
【背景技术】
[0002] 铜离子是生物体不可缺少的微量元素。在生物体内，铜主要是W与酶、蛋白质分子 W及一些生物小分子如氨基酸络合的状态存在。铜离子参与生物体一些重要的生理过程， 如细胞呼吸、神经递质的传递、抗氧化应激和铁离子的摄取都依赖于铜离子。人体许多疾病 与体内铜离子失衡有关，如肝豆状核变性、疯牛病、阿尔兹海默症和癌症等。神经退行性疾 病与铜蓝蛋白的丧失生物活性或Cu(I)毒性有关。铜离子在生物体内发挥的作用主要是基 于它氧化还原的化学性质，也就是Cu 2+和Cu+氧化态之间的转换。细胞内的一些重要生物化 学反应是由于两个氧化态之间的转换而得W进行。
[0003] 目前生物体大多只能定量测定总铜，并不能区分Cu(I)和化（n)。生物体系iig/L级 的痕量Cu(I)离子测定国内外迄今没有文献报道。在Cu(E)离子存在下，测定Cu(I)铜离子 面临着如何消除化（H)离子的干扰问题。在纯化学体系中测定Cu(I)离子时，Cu(I)离子很 容易被空气的氧所氧化，在无机溶液中很不稳定。但由于其能与联哇嘟形成高强度双配位 基Cu(I)离子配合物，且在有机溶剂中能稳定存在，因此可用分光光度法测定。但对生物样 本痕量的化(I)离子仍然无法用分光光度法测定。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方 法。
[0005] 本发明的上述目的是通过W下技术方案予W实现。
[0006] -种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法，包括如下步骤： 51. 标准工作曲线的制作:在惰性气体的保护下，将化Cl的标准品用饱和KCl溶液定容， 得到1000 ppm的亚铜标准溶液;取亚铜标准溶液与pH 9的甘氨酸-NaOH缓冲溶液按体积比1: 9混合，再向混合溶液中加入等体积的0.06%(w/w) 2 J/-联哇嘟的正戊醇溶液，混匀，静置 分层，取上层有机层用2 J/-联哇嘟的正戊醇溶液依次稀释成10、1、0.1、0.Olppm溶液，取 0.0 lppm溶液ImL上机，制作工作曲线； 52. -价铜的检测:将样品与等体积20%的S氯乙酸混匀，根据样品含铜量，再与抑9的 甘氨酸-化OH缓冲溶液按不同比例稀释，再向混合溶液中加入ImL的0.06%(w/w)2，2/ -联哇 嘟的正戊醇溶液，混匀，静置分层，取上层有机层，上机用石墨炉原子吸收法测定一价铜含 量； 其中，S2所述样品为血清时，取样品的上清液用缓冲溶液稀释20倍;S2所述样品为细胞 液、细胞膜液、组织液或尿液时，取样品的上清液用缓冲溶液稀释1倍;S2所述样品为不含蛋 白的无机溶液时，直接将样品用缓冲溶液稀释1倍。
[0007] 甘氨酸与Cu(n)能形成稳定的无机络合物，其稳定常数为15.1，且在pH 8-10范 围，极易生成配位比1:2的稳定铜氨络合物，所形成的甘氨酸馨合铜不溶于有机溶剂，其中 抑为卵寸最优。2,2/-亚铜试剂（2,2/-联哇嘟）是测定化（I)的特效试剂，与Cu(I)形成 的络合物能很好地溶解在有机溶剂而难溶于水。当含有甘氨酸的水溶液生物样本用含有2， 2/-联哇嘟的有机溶剂萃取时，就能将两者很好地分离在水相和有机相中，从而达到将两 种离子分离而达到分别测定的目的。分离后的有机相用石墨炉原子吸收测定Cu(I)，就能大 大提高测定化(I)的灵敏度。
[0008] 优选地，S2所述样品为含蛋白的样品时，将样品与=氯乙酸混匀后离屯、去蛋白，再 取去蛋白后的上清液进行后续步骤。含蛋白质的样品包括血清、细胞液、细胞膜液、组织液。 不含蛋白的无机溶液或其他生物体液如尿液，可减少去蛋白步骤。优选地，所述不含蛋白的 无机溶液包括矿泉水、自来水。
[0009] 优选地，所述离屯、为1200巧m离屯、1 Omin。
[0010] 优选地，S2所述样品为细胞液、细胞膜液或组织液时，另取未去蛋白前的样品测定 蛋白浓度，W蛋白含量定量一价铜浓度。S2所述样品为细胞液、细胞膜液或组织液时，因细 胞无法定量体积，故须另取未去蛋白前的样品测定蛋白浓度，用同体积的样本含铜量除W 含蛋白量，即每克蛋白所含的亚铜质量定量一价铜浓度。
[0011] 优选地，S2所述样品来自细胞时，将样品进行如下预处理:培养数天后的细胞收 集，超声或冰冻破碎后，分离得到的上清即细胞液，沉淀下来的细胞膜用适量表面活性剂溶 解，再作为样品进行测定。
[0012] 优选地，S1、S2所述混匀的方法为旋满振荡Imin。
[OOU]优选地，S1、S2所述缓冲溶液中的甘氨酸浓度含O.Olmol/L。
[0014] 优选地，S2所述上层有机层的上机量为50化L。
[0015] 与现有技术相比，本发明有益效果在于:本发明提供了一种生物样品中痕量一价 铜离子含量的检测方法，对探讨机体铜代谢失衡有重要意义。本发明方法能够区分Cu(I)和 Cu(n)，在测定Cu(I)时消除了 Cu(E)离子的干扰，对生物体系痕量Cu(I)离子的检测限达 0. l〇yg/L，相对偏差<5%。回收率:95~102〇/〇。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何 形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法 和设备。
[0017]实施例1 标准品准备:5g装的化Cl标准品开封后，用l(m ImL塑料管分装，小屯、充入氣气，将管内 空气驱净后用密封胶封好管口，并储存于放硅胶的干燥器中。
[0018] -种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法，包括如下步骤： SI.标准工作曲线的制作：配制工作曲线时，取出其中一管，称取CuCl的标准品 (99.999%，阿拉下)0.0156g置于10血容量瓶，用饱和KCl溶液稀释至刻度线，即得1000 ppm亚 Cu标准溶液，从中取10化L置于5血塑料管，力的00化抑为9 Glycine(甘氨酸)-化OH缓冲溶 液，再加1000化0 . 〇6%2，2/ -联哇嘟的正戊醇溶液，旋满振荡Imin,静置分层，上层即得 I(K)PPm亚铜标准溶液，再从上层有机层取10化L用2,2/ -联哇嘟的正戊醇溶液依次稀释成 10，1,0.1,0.Olppm溶液，用0.Olppm溶液上机，正戊醇为稀释剂做工作曲线。
[0019] S2.化（I)测定:将2(K)化血清样品与20化L20%S氯乙酸混匀，1200转离屯、IOmin去 蛋白，取血清上清液50化置5血塑料管内，加入95化L抑为9的甘氨酸Glycine-NaOH缓冲溶 液，混匀后加入1000化0. 〇6%2，2/ -联哇嘟的正戊醇溶液，旋满振荡Imin，静置分层后取上层 50化L，上机用石墨炉原子吸收法测定。
[0020] 所述样品还可为细胞液或其它生物体液等；当测定细胞液、细胞膜液或组织液时， 去蛋白后的液体与甘氨酸Glycine-NaOH缓冲溶液按1:1稀释，除了按上述步骤测定之外，另 取一定体积样本测定蛋白浓度，W蛋白含量定量亚铜浓度； 如果是不含蛋白的无机液或其它生物体液如尿液，就可减少去蛋白运个步骤。当需检 测细胞膜的Cu(I)时，培养数天后的细胞收集，超声或冰冻破碎后，分离得到的上清即细胞 液，沉淀下来的细胞膜可用适量表面活性剂(如2%Triton X-100)溶解，再作为样品进行测 定。
[0021] 按照上述方法对农夫山泉、自来水、尿血清、细胞液和细胞膜中的Cu(I)进行测定， 结果如表1。每组样品重复实验=次。
[0022] 表1不同样品的检测实例
注:yg/评ro:微克每克蛋白；TCu:总铜 该方法检测限:0.1化g/L，相对偏差<5%。回收率:95~102%。运对探讨人体铜代谢失衡 有重要意义。
[0023] 补充说明：1，由于不同样品中的亚铜均转移到了有机相才进行上机测定，故所有 样品都可用同一条工作曲线测定。
[0024] 2,上机样液一般为500至1000微升，故含萃取剂的有机相正戊醇只需要加 ImL。
【主权项】
1. 一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：51. 标准工作曲线的制作:在惰性气体的保护下，将CuCl的标准品用饱和KC1溶液定容， 得到lOOOppm的亚铜标准溶液;取亚铜标准溶液与pH 9的甘氨酸-NaOH缓冲溶液按体积比1: 9混合，再向混合溶液中加入等体积的0.06%(w/w) 2，2'-联喹啉的正戊醇溶液，混匀，静置 分层，取上层有机层用2，2'-联喹啉的正戊醇溶液依次稀释成10、1、0.1、0.01 ppm溶液，取 0.0 lppm溶液lmL上机，制作工作曲线；52. -价铜的检测:将样品与等体积20%的三氯乙酸混匀，根据样品含铜量，再与pH 9的 甘氨酸-NaOH缓冲溶液按不同比例稀释，再向混合溶液中加入lmL的0.06%(w/w)2，2'-联喹 啉的正戊醇溶液，混匀，静置分层，取上层有机层，上机用石墨炉原子吸收法测定一价铜含 量； 其中，S2所述样品为血清时，取样品的上清液用缓冲溶液稀释20倍;S2所述样品为细胞 液、细胞膜液、组织液或尿液时，取样品的上清液用缓冲溶液稀释1倍;S2所述样品为不含蛋 白的无机溶液时，直接将样品用缓冲溶液稀释1倍。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述样品为含蛋白的样品时，将样品与 三氯乙酸混匀后离心去蛋白，再取去蛋白后的上清液进行后续步骤。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心为1200 rpm离心10min。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述样品为细胞液、细胞膜液或组织液 时，另取未去蛋白前的样品测定蛋白浓度，以蛋白含量定量一价铜浓度。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述样品来自细胞时，将样品进行如下 预处理:培养数天后的细胞收集，超声或冰冻破碎后，分离得到的上清即细胞液，沉淀下来 的细胞膜用适量表面活性剂溶解，再作为样品进行测定。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，SI、S2所述混匀的方法为旋涡振荡lmin。7. 据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1、S2所述缓冲溶液中的甘氨酸浓度< 0.01mol/L〇8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述上层有机层的上机量为500yL。
【专利摘要】本发明属于微量元素检测技术领域，具体公开了一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法。本发明方法包括如下步骤：S1.标准工作曲线的制作；S2.一价铜的检测：将样品与等体积20%的三氯乙酸混匀，根据样品含铜量，再与pH9的甘氨酸-NaOH缓冲溶液按不同比例稀释，再向混合溶液中加入1mL的0.06%(w/w)2，2′-联喹啉的正戊醇溶液，混匀，静置分层，取上层有机层，上机用石墨炉原子吸收法测定一价铜含量。本发明方法可用于生物样本痕量一价铜含量的检测，对探讨机体铜代谢失衡有重要意义。
【IPC分类】G01N21/31
【公开号】CN105527235
【申请号】CN201511010910
【发明人】张源, 罗文鸿, 林哲绚, 韩溟, 李慧, 罗红军
【申请人】汕头大学医学院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月30日
文档序号 :
【 9764859 】
技术研发人员：张源,罗文鸿,林哲绚,韩溟,李慧,罗红军
技术所有人：汕头大学医学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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