一种测定胰岛素的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定胰岛素的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分：试剂R1：Tris缓冲液、聚乙二醇?8000、吐温?20、叠氮钠、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白，试剂R2：Tris缓冲液、氯化钠、叠氮钠、牛血清白蛋白、胶乳包被抗胰岛素抗体。制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的胰岛素的浓度。本发明具有检测准确度高等优点。
【专利说明】
一种测定胰岛素的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定胰岛素的试剂盒及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 胰岛素是由胰脏内的胰岛0细胞受内源性或外源性物质，例如葡萄糖、乳糖、核糖、 精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，胰岛素是机体内唯一降低血糖的 激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。
[0003] 1型糖尿病患者在确诊糖尿病之前，大部分患者胰岛0细胞发生自身免疫性破坏， 导致餐时和基础胰岛素分泌均减少，2型糖尿病患者胰岛0细胞功能异常进展缓慢，常表现 为外周胰岛素抵抗，因此胰岛素的检测对于糖尿病患者的诊断和分型以及治疗的监测均有 着重要的意义。
[0004] 目前，胰岛素的检测方法有免疫电泳法、免疫沉淀法、放射免疫法等，免疫电泳法和 免疫沉淀法操作繁琐，需要特殊的仪器和专业的操作，对技术人员要求较高，不适合临床快速 检测，放射免疫法含有放射性元素，对环境有很大的污染，同时也存在检测准确度不高的缺陷。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、污染环境以及测定准 确度低的缺陷，而提供一种测定胰岛素的试剂盒及其制备方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定胰岛素的试 剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20-60 g/L 吐温-20 10-35 g/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸钠 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 氯化钠 150~350 mmol/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体1~8g/L 其溶剂为纯化水。
[0007] 作为优选，本发明公开了一种测定胰岛素的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2 双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐温-20 20 g/L 叠氮钠 1.0 g/L 乙二胺四乙酸钠 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 叠氮钠 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体4g/L 其溶剂为纯化水。
[0008] 作为优选，所述的试剂R2中，所述的胶乳包被抗胰岛素抗体的制备方法为:先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80~500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质 量浓度为1%_5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化 二亚胺盐酸盐，在20°C_37°C的条件下反应1小时，反应完成后使用离心机，在25000 rpm/ min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释，然后使用超 声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min转速下离心30分钟，去上清，将沉 淀用50 mmo 1/L的MES缓冲液稀释，直至溶液中聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-3%为止，超声 分散，然后边分散边加入等体积的含8 mg/mL抗胰岛素抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在20 °C_37°C的条件下反应2小时，直至聚苯乙烯微球的最终质量浓度为1%时为止，然后加入牛 血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最终浓度达到15 g/L，4°C条件下封闭24小时，即可制备得 到胶乳包被抗胰岛素抗体。
[0009] 作为优选，本发明还公开了上述测定胰岛素的试剂盒的制备方法和使用方法，包 括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20~60 g/L 吐温-20 10-35 g/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸纳 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 氯化钠 150~350 mmol/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体1~8g/L 其溶剂为纯化水； (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的胰岛素的浓度。
[0010]作为优选，步骤(b)中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为2:1; 作为优选，步骤(b)中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:2到 1:20之间。
[0011]本发明的检测原理是:本发明利用抗原抗体反应，在胶乳颗粒上包被抗胰岛素抗 体，胰岛素胶乳抗体和样本中的胰岛素发生凝集反应，形成抗原抗体免疫复合物并产生一 定浊度，该浊度的高低与样本中的胰岛素浓度成相关，通过测定吸光度值并根据校准曲线 计算出胰岛素的含量。
式中：A At以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值 A As以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值 Cs校准液中INS的浓度。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明在试剂R1中添加了乙二胺四 乙酸钠，能够有效去除来自样本中金属离子的干扰，因此检测的准确度比较高，且通过在R1 中添加了聚乙二醇-8000作为加速剂，促进了反应迅速进行，灵敏度比较高，因此检测的准确 性比较好，而且本发明不含有任何放射性元素，不会对环境产生污染，另外操作也比较方便。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
[0015] 实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐温-20 20 g/L 叠氮钠 1.0 g/L 乙二胺四乙酸钠 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 叠氮钠 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体4g/L 其溶剂为纯化水。
[0016] 实施例2 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: Tris缓冲液 150 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐温-20 25g/L 叠氮钠 〇.3g/L 乙二胺四乙酸钠 6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris 缓冲液 20mmol/L 氯化钠 350 mmol/L 叠氮钠 1.7 g/L 牛血清白蛋白 10 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体3g/L 其溶剂为纯化水。 实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、 胶乳包被抗胰岛素抗体的制备:先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯 乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在37°C的条件下反应1小时，反 应完成后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释，然后使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释，直至溶液中聚 苯乙烯微球的质量浓度为3%为止，超声分散，然后边分散边加入等体积的含8 mg/mL抗胰岛 素抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在37°C的条件下反应2小时，直至聚苯乙烯微球的最终质量 浓度为1%时为止，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最终浓度达到15 g/L，4°C条 件下封闭24小时，即可制备得到胶乳包被抗胰岛素抗体； 2、 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐温-20 20 g/L 叠氮钠 1.0 g/L 乙二胺四乙酸钠 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 叠氮钠 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体4g/L 其溶剂为纯化水； 3、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 4、 检测步骤 (a) 取160yl试剂R1与20yl待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入80yl试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1; (d) 根据样本中的胰岛素(INS)的活性（uIU/mL)计算出样本中 的胰岛素的浓度。
[0017] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、胶乳包被抗胰岛素抗体的制备:先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯 乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为5%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在37°C的条件下反应1小时，反 应完成后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，然后将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释，然后使用超声分散仪进行超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释，直至溶液中聚 苯乙烯微球的质量浓度为3%为止，超声分散，然后边分散边加入等体积的含8 mg/mL抗胰岛 素抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在37°C的条件下反应2小时，直至聚苯乙烯微球的最终质量 浓度为1%时为止，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最终浓度达到15 g/L，4°C条 件下封闭24小时，即可制备得到胶乳包被抗胰岛素抗体； 2、 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 150 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐温-20 25g/L 叠氮钠 〇.3g/L 乙二胺四乙酸钠 6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris 缓冲液 20mmol/L 氯化钠 350 mmol/L 叠氮钠 1.7 g/L 牛血清白蛋白 10 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体3g/L 其溶剂为纯化水； 3、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 4、 检测步骤 (a) 取160yl试剂R1与20yl待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入80yl试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1; (d) 根据样本中的胰岛素(INS)的活性（uIU/mL)计算出样本中 的胰岛素的浓度。
[0018]表1为实施例1所制得的测定胰岛素的试剂盒以及实施例2所制得的测定胰岛素的 试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的胰岛素的浓度为18.14 uIU/mL， 测定结果见表1:
由表1可知，本发明所制得的测定胰岛素的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因 此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0019] 表2为实施例1所制得的测定胰岛素的试剂盒以及实施例2所制得的测定胰岛素的试剂 盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的胰岛素的浓度为58.10 uIU/mL，测定 结果见表2:
由表2可知，本发明所制得的测定胰岛素的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因 此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0020] 表3为实施例3所制得的测定胰岛素的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测 定以及实施例4所制得的测定胰岛素的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所 得的结果进行SD和CV的计算，结果如下： 表3
由表3可知本发明所制得的测定胰岛素的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实 施例3为最优的选择。
[0021]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种测定胰岛素的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组 分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20-60 g/L 吐温-20 10-35 g/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸纳 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 氯化钠 150~350 mmol/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体1~8g/L 其溶剂为纯化水。2. 根据权利要求1所述的一种测定胰岛素的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的试剂 R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 聚乙二醇-8000 40 g/L 吐温-20 20 g/L 叠氮钠 1.0 g/L 乙二胺四乙酸钠 4.0 mmol/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 叠氮钠 1.0 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体4g/L 其溶剂为纯化水。3. 根据权利要求1或2所述的一种测定胰岛素的试剂盒，其特征在于:所述的试剂R2中， 所述的胶乳包被抗胰岛素抗体的制备方法为：先用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80~ 500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1 %-5%的溶液，然后每毫 升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20°C_37°C的条 件下反应1小时，反应完成后使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清， 然后将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释，然后使用超声分散仪进行超声分散，再使用离 心机，在25000 rpm/min转速下离心30分钟，去上清，将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释， 直至溶液中聚苯乙烯微球的质量浓度为1%_3%为止，超声分散，然后边分散边加入等体积的 含8 mg/mL抗胰岛素抗体的MES缓冲液，混合搅拌，在20°C-37°C的条件下反应2小时，直至聚 苯乙烯微球的最终质量浓度为1%时为止，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最终 浓度达到15 g/L，4°C条件下封闭24小时，即可制备得到胶乳包被抗胰岛素抗体。4. 根据权利要求1或2所述的一种测定胰岛素的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征 在于:包括以下步骤： (a) 按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 聚乙二醇-8000 20-60 g/L 吐温-20 10-35 g/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 乙二胺四乙酸纳 1.5~6.5 mmol/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 20~180 mmol/L 氯化钠 150~350 mmol/L 叠氮钠 0.3~1.7 g/L 牛血清白蛋白 10~30 g/L 胶乳包被抗胰岛素抗体1~8g/L 其溶剂为纯化水； (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的胰岛素的浓度。5. 根据权利要求4所述的一种测定胰岛素的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在 于:步骤(b)中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为2:1。6. 根据权利要求4所述的一种测定胰岛素的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在 于:步骤(b)中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:2到1:20之间。
【文档编号】G01N21/31GK106053364SQ201610358104
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司
文档序号 :
【 10685084 】
技术研发人员：蔡晓辉,庄庆华,吴铮,徐运
技术所有人：安徽伊普诺康生物技术股份有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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